植物基因组的提取实验一

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1、植物基因组提取实验汇报汇报内容实验原理实验流程实验结果结果分析实验总结实验原理植物DNA的制备，必须首先注意植物细胞与动物及细菌细胞的不同：植物组织含有坚硬的纤维素，采用温和条件难以破碎细胞；植物细胞一般具有大的液泡，破碎细胞时有机酸随之逸出将使pH显著下降；通常植物细胞的DNA含量较低；植物中含有大量多糖、脂质、色素和酚类等物质。实验原理提取植物DNA的主要程序包括：破碎细胞壁，释放细胞内含物；破细胞膜及核膜使DNA释放到提取液中；除去DNA粗提液中含有的RNA、蛋白质、多糖、丹宁及色素等杂质。实验原理本实验中采用CTAB法提

2、取DNA。CTAB与核酸形成的复合物在高盐溶液中是可溶的，当溶液盐的浓度降低到一定的程度时，它将从溶液中沉淀，通过离心可将CTAB与DNA的复合物同蛋白质、多糖类物质分开。然后将此复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加入乙醇使核酸沉淀。因CTAB能溶于乙醇，离心后即可得DNA沉淀。实验原理DNA浓度（μg/mL）=（OD260nm/0.020×L）×稀释倍数式中：OD260nm为吸光度L为比色皿光径，单位cm0.020为1μg/mLDNA钠盐的光密度实验流程称取样品液氮研磨加入CTAB水浴保温氯仿/异戊醇氯仿/异戊醇95%乙醇加有RNas

3、e的TE缓冲液氯仿/异戊醇95%乙醇TE溶解NaAc和95%乙醇测定吸光度和琼脂糖凝胶电泳实验流程电泳加样量如下表所示。样品DNA样品DNA样品MarkerDNA样品DNA样品样品量/μL57.5101012.5染液量/μL11.5222.5实验结果第一次加入氯仿/异戊醇后，溶液由绿色变为白绿色，溶液中有绿色颗粒状固体。实验结果离心后，溶液分为3层，上层为亮黄色透明液体，中层为绿色块状固体，下层为深绿色液体。实验结果第2次加入氯仿/异戊醇后，溶液分为3层，上层为黄色透明液体，中层为橙色透明液体，下层为淡黄色泡状液体。实验结果离心后

4、，溶液分为2层，上层为黄色透明液体，下层为无色透明液体。实验结果加入95%乙醇后，随着搅拌，溶液由澄清变浑浊，有白色絮状物出现，并随着搅拌逐渐缠绕在玻璃榜上。实验结果电泳结果如下图所示，条带不够清晰并有拖尾现象。结果分析在加入氯仿/异戊醇后，溶液由绿色变为白绿色，这是因为氯仿是非极性分子，水是极性分子，当溶液与氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子被氯仿挤去，使蛋白质失去水合状态而变性。由于溶液中有变性蛋白质析出，因而由绿色变为白绿色。溶液中的绿色颗粒是研磨时未完全破碎的植物组织。结果分析经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而

5、与水相分离，沉淀在水相下面。而氯仿比重更大，保留在最下层。水层（DNA-CTAB复合物）变性蛋白质有机溶剂结果分析在用氯仿/异戊醇处理2遍之后，中层溶液较少，说明此时溶液中含有的变性蛋白质较少，进而说明溶液中的蛋白质基本除净。结果分析吸光度测定结果如下表所示。次数123吸光度0.0600.0610.060平均值0.060DNA浓度(mg/mL)0.9结果分析由图可见，各条带颜色较浅，这可能是由于：加样量偏少；加样过程中有样品从孔中溢出，而造成样品的损失；提取的样品中DNA含量偏低。结果分析由图可见，各条带均有拖尾现象。这可能是由于

6、：提取过程中DNA发生了降解；提取过程中由于机械损伤使DNA片段断裂；提取的DNA纯度不高，含有蛋白质、多糖等杂质；DNA样品受到了外源DNA的污染；电泳条件没有控制好；配置的胶的浓度不合适。实验总结各试剂的作用实验过程总结试剂作用Tris-HCl(pH8.0)提供的pH环境可防止核酸被酸水解。EDTA螯合Mg2+和Mn2+可抑制DNase的活性。试剂作用巯基乙醇能防止酚类氧化，使酚类容易除去。NaAc和乙醇用于沉淀DNA。1/10体积的NaAc和两倍样品体积的乙醇可有效沉淀DNA。RNase用于选择性的降解RNA。试剂作用氯仿可

7、以使蛋白失去水合状态而变性。在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。同时异戊醇也有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。实验总结在用液氮研磨时，要保证叶片始终处于冷冻状态，以减少叶片组织中含有的DNase对DNA的降解。95%的乙醇最好预先冷却，这样对DNA的析出比较有利。步骤的重复尽量减少，以减少DNA的损失。实验总结实验过程中要尽量避免外源DNA对样品的污染。在离心之

8、后，应尽量将不用的液层除净，以避免对之后的步骤产生影响。溶解DNA时所用TE的量应尽可能的少，以保证溶液中DNA的浓度不会太低。实验总结电泳时，尽量避免向靠近边缘的点样孔加样，以避免边缘效应对条带产生影响。点样时尽量避免样品从点样孔中溢出，而造成样