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《微卫星开发技术的研究进展【文献综述】》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、毕业设计文献综述生物科学微卫星开发技术的研究进展摘要现阶段国内外应用到的微卫星开发技术主要有6种，分别为直接文库筛选法、基于锚定PCR技术法、单引物延伸富集法、选择杂交富集法、生物信息学法、转移扩增法。本文主要对这6种开发技术进行综合评述,以期为从事微卫星标记开发的专业人士提供借鉴。关键词微卫星;开发技术;文库筛选微卫星(mierosatellite)又称为简单序列重复(simplesequeneerepeats，SSRs)，是一种由1一6个核昔酸为重复单位串连组成的长达几十个核昔酸的序列。它广泛存在于真核生物的基因组中，均匀分布在编码或非编码区，常表现出高度的长度多态
2、性。微卫星作为第二代分子标记,虽然在动植物遗传研究和育种实践中被广泛应用,然而其开发过程需要耗费相当的人力财力,因此选择一种合适的开发方法会起到事半功倍的效果。到目前为止用于微卫星开发的技术归纳起来包括6种。1 直接文库筛选法开发SSR标记最经典的方法是直接文库筛选法,基本过程包括基因组文库的构建、用微卫星探针杂交筛选文库、阳性克隆测序及引物设计几个步骤。构建基因组文库通常先将基因组DNA进行片段化处理,可以用限制酶消化,也可以用超声波、喷雾器等机械方法来打断,接着回收200～600多bp的DNA片段连接到载体,再转化大肠杆菌形成基因组文库。文库的筛选一般用同位素标记的
3、微卫星探针进行杂交筛选,有时也可以用PCR技术,用含微卫星的引物与载体引物组成引物对进行扩增筛选。最后是测序和引物设计。直接文库筛选法需要筛选大量的克隆,工作量大;此外假阳性率较高,冗余序列、不能设计引物的无效克隆占一定比例。该法在向日葵、小麦、甜瓜等植物微卫星开发中获得了成功。总体上这种方法SSR阳性克隆的效率为0.04%～12.00%,因此比较适合开发一些微卫星含量高的物种如鱼类或其他脊椎动物。2 基于锚定PCR技术的方法为了克服构建基因组文库的复杂过程,一些研究者提出了省略筛库法,此类方法都是基于PCR技术,如Fisher等发明了锚定PCR技术用来分离SSR标记,
4、原理非常简单,首先设计含有部分SSR序列的5′锚定引物,如KKVRVRV(CT)6就是一个锚定引物:(CT)6部分和基因组的GA重复序列配对,而V是不能和A配对的任意碱基,R是不能和G配对的任意碱基,K是G或T,这样使该引物稳固地结合到重复序列的5′部分,不至于滑动,保证了SSR的长度完整性。这种方法只需提取基因组DNA,然后直接用简并锚定引物扩增两个方向相反但距离较近的SSR序列,因此这种方法最少能分离2个SSR,有些时候在这两个末端SSR之间还可能存在含有完整侧翼序列的SSR,使获得的SSR达到3个以上。随后Hayden和Sharp在锚定PCR的基础上发明了2种SS
5、R分离方法,SAM和STMP法。SAM即选择扩增微卫星法,这一方法较锚定PCR技术复杂,具体过程包括基因组DNA双酶切消化、两种接头分子的连接、抑制PCR扩增连有不同接头的DNA片段,接着经过选择PCR、SAMPCR两步扩增,最后扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,回收含SSR条带进行克隆测序。STMP即序列标签文库法,由于该法过程过于繁琐,只有Hayden等在面包小麦微卫星标记的开发中使用过。虽然锚定PCR和SAM及STMP法省去了构建基因组文库的复杂过程,且只需设计一条特异引物与锚定简并引物扩增相应的SSR位点,节省了引物合成费用,但是这类方法由于只有一条特异引物,必然
6、会影响到扩增的特异性。目前这些方法在松科植物、芸苔属植物、荔枝、小麦等植物微卫星开发中被使用过。3 单引物延伸富集法为了提高微卫星开发效率,Ostrander等发明了单引物延伸富集法,该法用噬菌粒(pBluescript)构建基因组文库,随后用辅助噬菌体超感染产生单链环状DNA,以单链环状DNA为模板,用微卫星序列作引物进行延伸反应,形成双链环状DNA,转化大肠杆菌建成微卫星富集文库。类似的方法还有Paetkau等采用的生物素标记的单引物延伸策略,与Ostrander不同之处是Paetkau所用的构建初始文库的载体是噬菌体载体,因此不需要辅助噬菌体,直接从噬菌斑获得单链
7、DNA,随后用生物素标记的微卫星序列做延伸反应,形成环状双链DNA,再用链霉素磁珠捕获含有微卫星双链分子,变性后第2次用微卫星序列作延伸反应,形成双链环状DNA分子,也就是经过2次延伸富集,最后转化大肠杆菌形成富集文库。引物延伸富集法包含过多的实验步骤,操作比较复杂,而且Ostrander方法要求的大肠杆菌菌种特殊,应用受到局限。另外两种引物延伸富集方法都成功用于开发二核苷酸微卫星,Paetkau用四核苷酸微卫星序列作引物来分离微卫星,结果产生的阳性克隆在0～25%,而且多为冗余克隆。已报道成功应用单引物延伸程序开发微卫星标记的植物有豇豆
