三疣梭子蟹Crustin抗菌肽原核表达载体构建【开题报告】

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1、毕业论文开题报告生物科学三疣梭子蟹Crustin抗菌肽原核表达载体构建一、综述本课题国内外研究动态，说明选题的依据和意义三疣梭子蟹（Portunustrituberculatus）属于甲壳纲，十足目，梭子蟹科Portunidae、梭子亚蟹Portuninae，是中国沿海的重要经济蟹类。地方名：梭子蟹、枪蟹、海螃蟹。分布于中国南北各海域。一般从南到北，3～5月和9～10月为生产旺季，渤海湾辽东半岛4～5月产量较多。三疣梭子蟹是中国重要的出口畅销品之一[1]。近年来水产养殖业迅速发展，甲壳动物养殖在水产养殖业中占有极其重要的地位，但由于细

2、菌，病毒等引起的病害也日趋严重，对养殖业造成了很大的经济损失[2]。我国采用以各种抗生素来解决这问题[3]，但是大量并长期使用抗生素导致一些病原体细菌产生耐药性，致使部分水产品中的药物残留物增加或严重超标，威胁到食品安全同时也存在对人类的潜在威胁。由于目前水产养殖中抗生素耐药性菌种出现速度已经远远超过抗生素的研发速度，而且一些抗生素只针对一部分的病害，并不能抵御各类病原体的入侵。因此，急需研发与现有抗生素抗菌机理完全不同的新型抗菌物质。对此，研究绿色饲料添加剂及抗感染药剂代替抗生素成为当前饲料添加剂领域的一大研究热点[2]。抗菌肽(A

3、ntimicrobialpeptides)原指昆虫体内经诱导而产生的一类分子量在4KD左右，具有抗菌活性的碱性多肽物质,是脊椎动物，无脊椎动物和植物先天性免疫的关键因子。自Steiner等在天蚕(Hyaophoracecropia)中发现可诱导的抗菌肽后，不久从其他昆虫以及两栖类动物、哺乳动物中，也分离到结构相似的抗菌多肽。迄今为止，在不同动物组织中已发现了很多具有抗菌作用的蛋白质和多肽，已有70多种抗菌多肽的结构被测定，抗菌肽的概念得到了极大的扩展[1.4]。在甲壳类动物中，最初在食草蟹（Carcinusmaenas）的血细胞中发现

4、大小为6.5kDa的富含脯氨酸的阳离子多肽[5]，还在其大颗粒血细胞中发现了大小为11.5kDa的富含半胱氨酸的疏水蛋白Carcinin[6,7]，它只对革兰氏阳性菌有抗性[8]。Destoumieux等从凡纳滨对虾(Penaeusvannanme)的血细胞和血浆中分离出几种抗菌蛋白，其中有3种具有抗真菌和抗革兰氏阳性菌的活性[9]。尽管抗菌肽的结构不同，但几乎所有抗菌肽都具有一些共同的特征[10],天然抗菌肽通常是由12-26个氨基酸组成的小分子阳离子多肽，由于富含赖氨酸，精氨酸和组氨酸等碱性氨基酸，抗菌肽通常带有2-7个正电荷，等

5、电点大于7，表现较强的阳离子特征[11]Crustins是目前报道广泛存在于甲壳类中的一类具有广谱抗菌活性免疫因子[12]，甲壳类crustins的C末端是WAP域，该结构在其他动物中是一个紧密的蛋白酶抑制剂结构。甲壳类crustins因其独特的WAP结构为解决蛋白质易被蛋白酶降解，影响生物活性及保存期的问题提供了良好的基础。本研究目的在于构建原核表达体系，在大肠杆菌中表达三疣梭子蟹crustins，获得具有生物活性的重组crustins，为开发梭子蟹饲料添加剂奠定基础。二、研究的基本内容，拟解决的主要问题：甲壳类Crustins由于

6、其独特的WAP结构为解决蛋白酶降解及活性结构稳定性问题提供良好的基础，同时由于甲壳类Crustins存在大量的异构体，为筛选特殊要求的Crustins提供了丰富的空间。本研究目的在于构建原核表达体系，在大肠杆菌中表达梭子蟹crustins，获得具有生物活性的重组crustins，并初步研究其理化性质，为开发梭子蟹来源crustins渔用饲料添加剂奠定基础。三、研究步骤、方法及措施：一）试验步骤：构建梭子蟹crustins基因原核表达载体，在大肠杆菌中表达梭子蟹crustin，并初步研究重组蛋白理化性质。（二）研究方法：构建目的基因片段

7、克隆载体，pET-28a原核表达载体的构建（三）措施设计引物扩增目的基因，目的基因连接克隆载体，目的基因和pET-28a原核表达载体连接四、参考文献[1]欣华.水产饲料发展趋势.农村养殖技术,2003,(12):27-29.[2]麦康森.水产饲料与养殖产品安全.科学养鱼,2008,(01):4-5.[3]李洪淼.抗菌肽的研究进展及应用前景.饲料博览,2007,(1):15-17.[4]SchnappD,KempGD,SmithVJ.PuricationandCharacterizationofaProlinerichAntibacte

8、rialPeptide,withSequenceSimilaritytoBactenecin-7,FromtheHaemocytesoftheShoreCrab,CarcinusMaenas[J].EurJBiochem