三疣梭子蟹hyastatin抗菌肽原核表达的构建【开题报告+文献综述+毕业论文】.doc

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1、本科毕业论文开题报告生物科学三疣梭子蟹hyastatin抗菌肽原核表达的构建一、论述甲壳类抗菌肽研究现状，说明选题的依据和意义甲壳动物养殖在全世界水产养殖业屮占有极其重要的地位，但由细菌、病毒等引起的病害往往造成严重的经济损失。甲壳动物的病害防治，至今仍是水产界面临的难题Z—•使用抗牛素虽可部分地解决这一问题，但大量使用抗牛素，会破坏养殖水环境和甲壳动物体内的微牛态平衡，导致某些病原体产牛耐药性，进而对人类的健康构成潜在性威胁。因此，寻求高效、环保的甲壳动物病害防治方法及防治药物，一直是人们努力的方向。近年来，随着甲壳动物防卫

2、机制研究的不断深入，采用免疫学方法防治甲壳动物病害不仅成为了可能，血且已取得了初步的成效。抗菌肽广泛存在于自然界屮，在寄主先天性免疫机制屮占有重要地位。尽管己经对其他节肢动物（包括昆虫和螯肢动物）体内的人量抗菌肽进行了研究鉴定，对甲壳动物体内分离出来的抗菌肽的研究报道却较少。甲壳动物的抗菌肽主要存在于血液

3、Po1988年Nakamuni等在蛍血细胞里发现一种17个氨基酸的抗菌肽，命名为蠻素achypiesin）,这是首次从海洋牛物111发现的抗菌肽。它在低浓度'卜就能抑制G-菌和G+菌的牛长，并对真菌、流感病毒A、口腔疱疹病毒

4、和获得性免疫缺陷综合症病毒有抗性。Pierce等从卷血细胞屮分离到的抗菌肽，采用融合蛋白方法使其基因在大肠杆菌屮表达，同时避免伤害大肠杆菌，获得具有与天然抗菌肽相似的、能有效地抑制原牛动物病原体的表达产物。Saito等还从蛍体上分离到一个79个氨基酸残基组成的抗菌肽，分子与兔和牛的嗜中性白血球防御素相似。Schnapp等从岸蟹｛Carciniismaenas)11［分离得到3种具有杀菌作H］的肽，并对其屮的6.5kD抗菌肽进彳亍了部分序列分析，这种抗菌肽富含脯氨酸，同Bactcnccin7有60%的同源性。报道了岸蟹的11.5

5、RD抗菌肽，这种肽在100C下处理lOmin不丧失抗菌活性，但仅对海洋革兰氏阳性菌有抑制。Khoo从蓝蟹(Callinectessapidus)111分离出Callinectin,其抗E.coliD31的致死浓度为1.44umol/LoChisholm等在龙虾和对虾等8利呷壳动物的血细胞溶胞Chisholm［17］等在龙虾和对虾等8种甲壳动物的血细胞溶胞Chisholm等在龙虾和对虾等8种甲壳动物的血细胞溶胞对虾和克氏原螯虾(Procambarusclarkii)fill组织提取液卩分离出具有抗DNA病毒和RNA病毒活性的抗菌

6、肽。1997年Destoumieux等从凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)血细胞和血浆〔

7、'分离儿种抗菌肽，测定-K'P3种多肽氨基酸序列，首次报道甲壳动物抗菌肽氨基酸全序列。它们均为富含脯氨酸的阳离子多肽，具有抗真菌和抗细菌活性。由于近年来由于养殖规模的不断扩大以及养殖集约化程度的不断提高，三疣梭子蟹养殖病害也频频爆发，制约了三疣梭子蟹养殖业的进一步发展。克隆三疣梭子蟹免疫相关基因，研究免疫基因的功能和作用机制，可为三疣梭子蟹养殖病害的防治以及遗传育种奠定良好基础。二、研究的基本内容，拟解决的主要问题：研究

8、的基本内容：1.把三疣梭子蠻hyastatin抗菌肽的相关基因分离纯化；2.检测三疣梭子蟹hyastatin抗菌肽相关基因的表达机制及活性研究;解决的主要问题：1・hyastatin抗菌肽分离纯化技术；2.PCR反应体系的确定及重组蛋白的纯化研究；三、研究步骤、方法及措施:研究步骤：一、查阅相关文献，给出合理的研究方案；二、材料的预处理；三、质粒的有效捉取；四、PCR反应体系的确定；五、H的基因片段的获得，表达载体的构建六、PCR扩增，酶切，割胶回收；七、测序结果预测，测序，纯化；八、研究性报告的撰写，定稿；方法，措施：以包含

9、hyastatin基因全长cDNA的克隆子为模板，用设计的引物对扩增获得研究所需hyastatin基因cDNA片段；酶切扩增的H的基因片段和表达载体，割胶回收；DNA连接酶连接H的片段和表达载体，构建重组的表达载体，转化宿主菌培养；提取质粒，卩CR扩增及测序验证重组连接是否成功、有龙移码突变等；重组蛋白的纯化，扩增及保种；四、参考文献［1］贾素娟，路福平,王昌禄，杜连祥;牛物抗菌多肽［J］；氨基酸和牛物资源;2000年04期.［2］三疣梭子Profilin基因全长cDNA的克隆与表达分析・动物学研究2010,31(3)・［3］

10、李义;吴婷婷;李红霞甲壳动物抗微牛物肽研究进展［期刊论文］■水牛牛物学报2006(04).[4]HuangWS^WangKJ,YangM,etal.PurificationandpartcharacterizationofanovelantibacterialproteinS