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1、MTHFRC677T基因与冠心病相关性调查研究实验记录DNA的提取一、试剂配制1.溶血试剂:0.32M蔗糖55g1MTris-cl(PH:7.5)0.5ml0.005MMgcl21g1%TritoneX-1005mg加水至500ml注：①1MTris-cl(PH:7.5)：称取24.23gTris于200ml蒸馏水中，用浓Hcl调PH值为7.5。②1%TritoneX-100：量取2mlTritoneX-100原液，加蒸馏水至200ml。③溶血试剂的配制：称取55g蔗糖及1gMgcl2置于大烧杯中，同时加入5ml1%TritoneX-100和500ulTris-cl(PH:7.5)，使其充分
2、溶解，定容至500ml。2.细胞裂解液(STE)缓冲液:Tris-cl(PH:7.5)10mmol/LNacl10mmol/LEDTA1mmol/L注：称取0.30285gTris，0.1461gNacl及0.0731gEDTA，置于大烧杯中，加蒸馏水使其充分溶解，定容至250ml。1.TE缓冲液:Tris-cl(PH:7.4,7.5,8.0)10mmol/LEDTA(PH:8.0)1mmol/L注：称取0.12114gTris及0.2923gEDTA，置于小烧杯中，加蒸馏水使其充分溶解，定容至100ml。2.裂解液:STE900ul10%SDS60ul蛋白酶K12ul注：①10%SDS：称
3、取20gSDS，置于小烧杯中，加蒸馏水使其充分溶解，定容至200ml。3.饱和酚、氯仿、氯仿:异戊醇(24:1)4.3molNaAC5.无水乙醇、70%酒精,放入-20℃预冷二、DNA提取步骤:1.将血样(EDTAK3抗凝)从-40℃冰箱取出置室温下融化,同时将其编号记录.2.提取白细胞:①将血液到入50ml离心管中,用溶血试剂反复冲洗采血管,加入约20ml.②将50ml离心管盖紧瓶盖后,至于旋涡混匀器上充分震荡混匀.③将50ml离心管放入大离心机4000rpm离心15min,弃上清.④加20ml溶血试剂重复一次,并4000rpm,离心10min,弃上清,沉淀即为淋巴细胞.3.裂解白细胞:①
4、向装有沉淀物的离心管中加入900ulSTE,60ul10%SDS,12ul蛋白酶K后,将沉淀重悬分别移入2个1.5mlEP管中.②55℃水浴锅中处理2h.③100℃煮沸7min,然后立即放入-20℃冷却5min.4.酚.氯仿抽提DNA.①向每个1.5mlEP离心管中加入等体积的酚(约480ul饱和酚),将盖子盖紧后颠倒混匀后12,000rpm,离心5min,小心将上清移入新的离心管中.②加入等体积的氯仿:异戊醇液约480ul,混匀后12,000rpm,离心5min,小心将上清移入新的离心管中.5.乙醇沉淀DNA:①加入水相体积1/10的3molNaAc和2倍体积的冰冻保存的无水乙醇,充分混匀
5、后放-30℃冰箱冷却30min,取出后12,000rpm,离心10min,弃上清.②加入1ml70%酒精(-20℃预冷),随即12,000rpm,离心10min,弃上清,至于4℃冰箱使其自然干燥.③次日将每管加入20ul的TE缓冲液保存.PCR扩增一、试剂配制1.TagDNA聚合酶,10×buffer，Mgcl2，dNTPs等购与华美生物工程公司北京分公司.2.引物的合成:根据文献设计两对引物,序列分别为:Forward:5´-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3´Reverse:5´-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3´引物由北京塞百盛基因技术有限公司合成,按合成后
6、所提供的DNA的OD值配成1ug/ul浓度.3.模板的制备:DNA提取物4.电泳用琼脂糖：称取1g琼脂糖倒入50ml1TAE中，将三角瓶充分混匀后，放入微波炉中火段，3min将胶溶解，稍凉一下，加1ul10mg/ml溴化乙锭溶解并混匀，等稍凉后，倒入电泳槽中,使胶均匀的铺平，避免汽泡的产生。5.50×TAE电泳缓冲液:Tris121g冰乙酸28.55ml1molEDTA25ml(PH8.0)加水至500ml6.6×上样缓冲液溴酚兰0.25%40%蔗糖水溶液50ml二、PCR反应体系：10buffer2.5ulMgcl2(25mMol)1.5ul4×dNTP(each2.5mMol)2ulP1
7、P2}each10mMol2.5ulDNA模板2ulTagDNA聚合酶0.5ulddH2O14ul总反应体系为25ul三、PCR反应条件：预变性94℃5min变性94℃30s退火63℃30s30个循环延伸72℃30s72℃延伸7min四、PCR反应结果：配置2％琼脂糖凝胶，取PCR扩增产物5ul，按5：1的比例与6×上样缓冲液混合，加入加样孔中，于1×TAE电泳液中电泳1h，在凝胶呈像仪下观察结果，廓增片段为
