细胞重组与克隆技术教案

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1、第7章细胞重组与克隆技术主要内容：7.1细胞重组7.2克隆技术7.1细胞重组7.1.1细胞重组的定义细胞重组（CellReconstruction）,又称细胞拆合是指从活细胞中分离出细胞器及其组分，然后在体外一定条件下将不同细胞来源的细胞器及其组分进行重组，使其重新装配成为具有生物活性的细胞或细胞器的一种实验技术。在探讨真核细胞的起源时。马吉利斯(MaRdls)曾于1972年提出了内共生学说：真核细胞起源于原核细胞，是几个原核细胞共生结合的结果。如蓝阴滴虫，细胞内含叶绿体，就是蓝藻在阴滴虫内共生的结果；绿草履虫体内的绿色物体，就是与之共生

2、的一种小球藻。这种不同细胞的结合过程类似于细胞的自然装配。细胞的生长过程包含着细胞器的自我装配，但这是一种活体的自我装配，而细胞重组则是离体的装配过程。7.1.2细胞重组的意义细胞重组技术是现代生物工程中的热点课题，细胞重组与细胞融合技术是细胞工程中的细胞或细胞器水平上主要构建手段，它与基因转移技术、干细胞技术等结合，可以人为地获得新物种或使细胞表达新的性状和新的产物。7.1.3细胞重组技术发展概况7.1.4几个重要概念胞质体(Cytoplast)：是指除去细胞核后由膜包裹的无核细胞。微细胞(Microcell)：是指只有一条或几条染色体

3、和一薄层细胞质，外面包裹一层完整的细胞质膜的核质体。核体(Karyoplast)：是指与胞质分离得到的细胞核，带有少量胞质并围有质膜，称为核体。7.1.5细胞重组的方式胞质体(Cytoplast)：与完整细胞重组形成胞质杂种(Cybrid)。微细胞(Microcell)：与完整细胞重组形成微细胞异核体(Heterokaryon)。胞质体与核体(Karyoplast)：重新组合形成重组细胞。7.1.6细胞重组技术1、显微操纵术一般是在显微解剖镜下，把细胞放入消毒的培养液中，同时放入冷却系统中以减慢细胞发育，然后借助一台专门的装置——显微操作

4、仪，用细微玻璃针或用微细管、微电极、微热电偶等斜插入细胞中去，可以挑取细胞核，人工造就去核细胞；也可以进一步作移核实验与电生理实验。用这种仪器能够进行细胞各部分的解剖、细胞各部分物质的抽取和移植、各物质的注入、测量微电位的变化等等。意义:1、实现细胞的拆合2、为研究细胞内的基因表达与调控和改良动物品种提供了一种重要手段。2、细胞分离技术分离细胞主要是根据细胞本身的某些特殊性质来选择合适的分离技术来分离具有同一性状的细胞群、这些性质包括：细胞大小、密度、表面电荷、表面标志、细胞中一个或多个成分的荧光强弱、细胞对其他介质的吸附作用经常采用的细

5、胞分离方法如下：（1）差速离心（differentialcentrifugation）　　在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体。（速度升高，样品按大小先后沉淀）　　由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠，而且某些慢沉降颗粒常常被快沉降颗粒裹到沉淀块中，一般重复2～3次效果会好一些。　　差速离心只用于分离密度和大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞器。对于精细的分离，则是密度梯度离心效果更好。（2）梯度沉降分离法主要

6、是根据细胞大小不同分离细胞、细胞在单位重力作用下，通过密度介质、或在低离心力作用下通过梯度密度溶液沉降，由于细胞大小不同，沉降速度不同。细胞大，沉降快。常采用适当的分离介质形成一定的梯度密度溶液．这此介质主要有：血清、蔗糖等：（3）等密度沉降分离法主要是根据细胞密度差异来分离细胞。细胞在连续密度梯度分离介质中、受强离心力的作用，最后到达与其密度相同的分离介质层面，并保持平衡。如果是非连续密度梯度介质中，细胞主要集中在介于其自身密度的两种密度介质交界面上，从而达到分离的目的。目前常采用的分离介质有蛋白等。密度分离剂应该具有无刺激，对细胞无吸

7、附作用，产生的渗透压小等特点（4）流式细胞仪分离法这种方法是以免疫荧光法使荧光抗体与细胞膜表面抗原结合，然后用超声波处理使其分散成单个细胞，再将细胞悬浮液通过一个直径为50um的喷嘴变成极细小的微滴，每个微滴一般含有一个细胞，以l0m/s的速度喷出。经激光照射是细胞上所带荧光被激发而转换成脉冲．通过测定脉冲数就可以换算出各种不同细胞表面抗原的情况。同时由于悬浮微滴中的细胞带有不同程度的负电荷，这样在施加电场后。移行偏斜的程度不同，而不带电荷的细胞仍以直线流过、借此可以收集得到不带电荷或带电荷多少不同的各种细胞。这种方法优点是分离速度快，分

8、离得到的细胞仍能保持其功能；缺点是需要专门的设备。3、细胞破碎方法细胞器的分离需要将组织细胞破碎，常用的方法有：超声波破碎法；反复冻融法；化学裂解法；高速组织捣碎法。（1）超声波破碎法原理是：