基因枪法将Bhlea2基因导入玉米的初步研究

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1、基因枪法将Bhlea2基因导入玉米的初步研究摘要：构建了牛耳草（ｂｏｅａｈｙｇｒｏｍｅｔｒｉｃａ）胚胎发育晚期丰富蛋白基因（ｂｈｌｅａ２）的植物表达载体ｐｙｌ１，以玉米（ｚｅａｍａｙｓｌ．）自交系５０１的愈伤组织为受体，利用基因枪法将ｂｈｌｅａ２基因导入，获得５１株抗性植株，经ｐｃｒ检测有１０株阳性植株，阳性率为１９．６％，初步证明外源基因已整合到玉米基因组中。关键词：玉米（ｚｅａｍａｙｓ）；愈伤组织；ｂｈｌｅａ２基因；基因枪法ｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｂｈｌｅａ２ｇｅｎｅｉｎｔｏｍａｉｚｅｂｙｐａｒｔｉｃｌｅｂｏｍｂａｒｄｍｅ

2、ｎｔｚｏｕｌｕ－ｌｉｎ１，２，ｗｅｉｊｉａｎ－ｈｕａ２，ｚｈａｎｇｓｈａｏ－ｂｉｎ１，ｗａｎｇｈｏｎｇ－ｚｈｉ２（１．ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓｃｉｅｎｃｅａｎｄｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｃｏｌｌｅｇｅ，ｓｈｅｎｙａｎｇａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ｓｈｅｎｙａｎｇ１１０８６６，ｃｈｉｎａ；２．ｂｅｉｊｉｎｇａｇｒｏ－ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｒｅｓｅａｒｃｈｃｅｎｔｅｒ，ｂｅｉｊｉｎｇａｃａｄｅｍｙｏｆａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌａｎｄｆｏｒｅｓｔｒｙｓｃｉｅｎｃｅ，ｂｅｉｊｉｎｇ１０００９７，ｃｈｉｎａ）ａｂｓｔｒａｃｔ：ｔｈｅｅｘｐｒｅｓ

3、ｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐｙｌ１ｏｆｂｈｌｅａ２ｇｅｎｅｆｒｏｍｂｏｅａｈｙｇｒｏｍｅｔｒｉｃａｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．ｔｈｅｂｈｌｅａ２ｇｅｎｅｗａｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃｃａｌｌｕｓｏｆｍａｉｚｅ（ｚｅａｍａｙｓ）ｉｎｂｒｅｄｌｉｎｅ５０１ｂｙｐａｒｔｉｃｌｅｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ．５１ｐｌａｎｔｓｗｉｔｈｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄａｎｄ１０ｏｆｔｈｅｍｗｅｒｅｃｏｎｆｉｒｍｅｄｐｏｓｉｔｉｖｅｂｙｐｃｒａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ｔｈｅｆｒｅｑｕｅｎｃｙｏｆｐｏｓｉｔｉｖｉｔｙｗａｓ１９．６

4、％，ｉｔｗａｓｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｉｌｙｐｒｏｖｅｄｔｈａｔｔｈｅｅｘｔｒａｎｅｏｕｓｇｅｎｅｈａdｂｅｅｎｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｉｎｔｏｍａｉｚｅｇｅｎｏｍｅ．ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｍａｉｚｅ（ｚｅａｍａｙｓ）；ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃｃａｌｌｕｓ；ｂｈｌｅａ２ｇｅｎｅ；ｐａｒｔｉｃｌｅｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ玉米（ｚｅａｍａｙｓｌ．）是全球最重要的粮、经、饲三元作物，我国玉米的总产量仅次于水稻，占世界总产量的２０％左右，同时，我国也是玉米的第一消费大国［１］。然而，由于气候、地理以及玉米自身的水分生理状况等原因，干旱已成为限制玉米高产稳产的主要非生物胁

5、迫因素之一［２－８］。目前，通过转基因手段培育耐旱品种，改良玉米干旱胁迫耐受性是最为有效的途径之一［９，１０］。胚胎发育晚期丰富蛋白（ｌｅａ蛋白）是一类高度亲水的小分子蛋白质，在植物和动物中广泛分布，大多与细胞脱水过程密切相关。很多ｌｅａ蛋白在成熟的种子中积累，在种子萌发后迅速消失。ｂｈｌｅａ２基因是复苏植物苦苣苔科旋蒴苣苔属植物牛耳草（ｂｏｅａｈｙｇｒｏｍｅｔｒｉｃａ（ｂｕｎｇｅ）ｒｂｒ．）中ｌｅａ蛋白的编码基因，在烟草中过量表达可显著提高转基因烟草的耐旱性［１１－１６］。目前，基因枪介导的转基因方法较为完善［１７］，本研究利用基因枪法将耐旱基

6、因ｂｈｌｅａ２导入玉米的愈伤组织，为提高玉米耐旱性的研究奠定基础。１材料与方法１．１材料与试剂供试品种为玉米自交系５０１（京玉７号－５０１／京２４的亲本之一），供试原始质粒载体为ｐｂｉｎ１９－ｂｈｌｅａ２、ｐｕｂｉ－ｂａｒ和ｐｂｐｃ２６，由北京农业生物技术研究中心保存。限制性内切酶、ｔａｑｄｎａ聚合酶、ｉｐｔｇ、ｘ－ｇａｌ等购自大连宝生物工程有限公司（ｔａｋａｒａ）；高保真ｔａｑ酶和ｋｏｄ酶购自东洋纺（上海）生物科技有限公司；ｐｇｅｍｒ－ｔｅａｓｙｖｅｃｔｏｒ、ｔ４ｄｎａ连接酶购自普洛麦格（北京）生物技术有限公司；质粒提取试剂盒、ｄｎａ凝胶回收试

7、剂盒、基因组ｄｎａ提取试剂盒及ｄｎａ电泳ｍａｒｋｅｒ购自天根生化科技（北京）有限公司和北京全式金生物技术有限公司；氨苄青霉素购自北京奥赛博科技发展有限公司。诱导、继代培养基：ｎ６基本培养基＋１００ｍｇ／ｌ肌醇＋２ｍｇ／ｌ２，４－ｄ＋１０ｍｇ／ｌａｇｎｏ３＋３０ｇ／ｌ蔗糖＋４ｇ／ｌｐｈｙｔａｇｅｌ；筛选培养基：诱导培养基＋２ｍｇ／ｌｂａｒ；分化培养基：ｎ６基本培养基＋１００ｍｇ／ｌ肌醇＋０．５ｍｇ／ｌａｇｎｏ３＋１．５ｍｇ／ｌｋｔ＋３０ｇ／ｌ蔗糖＋４ｇ／ｌｐｈｙｔａｇｅｌ＋１ｍｇ／ｌｂａｒ；生根、壮苗培养基：１／２ｍs基本培养基＋１００ｍｇ／ｌ肌醇

8、＋３０ｇ／ｌ蔗糖＋４ｇ／ｌｐｈｙｔａｇｅｌ＋０．５ｍｇ／ｌｎａａ＋２ｍｇ／ｌ多效唑。１．２方法１．２．１ｂｈｌｅａ２基因表达载体的构建利