微生物限度检查法-药典附录

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1、微生物限度检查法微生物限度检查法（2005年版一部）附录XIIIC.微生物限度检查法微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括细菌数、霉菌素、酵母菌数及控制菌检查。微生物限度检查应在环境洁净度1OOOO级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物的生长和存活无

2、影响。除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30〜35°C,霉菌、酵母菌培养温度为25〜28°C,控制菌培养温度为36°C±rCo检验结果的报告以1g、1mk10g、10ml或lOcm?为单位报告。检验量检验量即一次试验所用的供试品（g、ml或cm2＞）。除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml；中药膜剂为50cm2；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。要求检查沙门菌的供试品，其检验应增加10g或10ml。检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，大蜜丸还不得少于4丸，膜剂还不得少于4片。一般应随机抽取不少于检验用量（两个以上最小

3、包装单位）的3倍量供试品。供试液的制备根据供试品的理化特性与生物学特性，可采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需用水浴加温时，温度不应超过45°C。供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。除另有规定外，常用的供试液制备方法如下。1•液体供试品取供试品10ml,加PH7.0无菌氯化钠•蛋白月东缓冲液至100ml,混匀，作为1：10的供试液。油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。2•固体、半固体或黏稠性供试品取供试品10g,加PH7.0无菌氯化钠•蛋白腺缓冲液至100ml,用匀浆仪或

4、其他适宜的方法，混匀，作为1：10的供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80,并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。3•需用特殊供试液制备方法的供试品（1）非水溶性供试品方法1取供试品5g（5ml）,加入含溶化的（温度不超过45°C）5g司盘80、3g单硬脂酸廿油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45°C左右的PH7.0无菌氯化钠■蛋白腺缓冲液至100ml,边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1:20的供试液。方法2取供试品10g,加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯（制法见附录XIIIB无菌检查法中供试品的无菌检查项下

5、）和无菌玻璃珠的适宜容器中，必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。然后加入45°C的PH7.0无菌氯化钠■蛋白腺缓冲液100ml,振摇5-10分钟，萃取，静置使油水明显分层，取其水层作为1：10的供试液。（2）膜剂供试品取供试品100cm2,剪碎，加50ml或100ml的PH7.0无菌氯化钠•蛋白腺缓冲液（必要时可增加稀释液），浸泡，振摇，作为1：10或1：20的供试液。（3）肠溶及结肠溶制剂供试品収供试品10g，加pH6・8无菌磷酸盐缓冲液（用于肠溶制剂）PH7.6无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制剂）至100ml,置45°C水浴

6、中，振摇，使溶解，作为1：10的供试液。（4）气雾剂、喷雾剂供试品取规定量供试品，置冰冻室冷冻约1小时，取出，迅速消毒供试品开启部位，用无菌钢锥在该部位钻一小孔，放至室温，并轻轻转动容器，使抛射剂缓缓全部释出。用无菌注射器吸出全部药液，加至适量的PH7.0无菌氯化钠■蛋白腺缓冲液（若含非水溶性成分，加适量的无菌聚山梨酯80）中，混匀，取相当于10g或10ml的供试品，再稀释成1：10的供试液。（5）具抑菌活性的供试品当供试品有抑菌活性吋，应消除供试液的抑菌活性后，再依法检查。常用的方法如下。①培养基稀释法収规定量的供试液，至较大量的培养基中，使单位

7、体积内的供试品含量减少，至不含抑菌作用。测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数时，取同稀释级的供试液2ml,每lml供试液可等量分注多个平皿，倾注琼脂培养基，混匀，凝固，培养，计数。每lml供试液所注的平皿屮生长的菌数Z和即为1ml的菌落数，计算每1ml供试液的平均菌落数,按平皿法计数规则报告菌数；控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量。②离心沉淀集菌法取一定量的供试液，3000转/分离心20分钟（供试液如有沉淀，先以500转/分离心5分钟，収全部上清液再离心），弃去上清液，留底部集菌液约2ml,加稀释液补至原量。③薄膜过滤法见细菌、霉菌及酵母菌计数项下的''

8、薄膜过滤法〃。④中和法凡含汞、碑或防腐剂等具有抑菌作用的供试品，可用适宜的中和剂或灭活剂消除英抑菌成分。中和剂或灭活剂可加