TET3在牛早期胚胎发育过程中的作用研究

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1、分类号：Ｑ８５２．１单位代码：１０１８３研究生学号：２０１５８５２０１３密级：公开吉林大学硕士学位论文学术学位（）ＴＥＴ３在牛早期胚胎发育过程中的作用研究ＥｆｆｅｃｔｏｆＴＥＴ３ｏｎｂｏｖｉｎｅｅａｒｌｅｍｂｒｏｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔｙｙｐ作者姓名：张建专业：基础兽医学研究方向：干细胞与动物克隆指导教师：唐博副教授培养单位：动物医学学院２０１８年６月未经本论文作者的书面授权，依法收存和保管本论文书面版本、电子版本的任何单位和个人，均不得对本论文

2、的全部或部分内容进行任何形式的复制、修改、发行、出租、改编等有碍作者著作权的商业性使用（但纯学术性使用不在此限）。否则，应承担侵权的法律责任。吉林大学硕士学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交学位论文，是本人在指导教师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成。果对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。■Ｈ学位论文作者签名：ｔ

3、年ｆ月曰＞TET3在牛早期胚胎发育过程中的作用研究EffectofTET3onbovineearlyembryodevelopment作者姓名：张建专业名称：基础兽医学指导教师：唐博副教授学位类别：农学硕士论文答辩日期：2018年06月03日本研究得到国家自然科学基金(No.31472093),国家科学和技术重大项目(No.2014ZX-08-007-002-008)和PCSIRT(IRT_16R32)的资助ThisworkwassupportedbygrantsfromNaturalScienceFou

4、ndationofChina(No.31472093),NationalScienceandTechnologyMajorProjects(No.2014ZX-08-007-002-008)andPCSIRT(IRT_16R32).中文摘要TET3在牛早期胚胎发育过程中的作用研究DNA甲基化是真核生物基因组中主要的表观遗传修饰之一，其在许多生物过程（包括胚胎发育）中起到调节基因表达的作用。基因组DNA甲基化图谱由DNA甲基化和DNA去甲基化这两个双向、可逆过程维持形成，其动态变化对于哺乳动物胚胎的早期发育至关重要

5、。目前，已经提出了DNA去甲基化的复制依赖性“被动”模型和复制无关的“主动”模型。DNA被动去甲基化是通过DNA复制介导的稀释而发生的，而主动去甲基化则需要TET家族成员作为氧化酶来去除DNA胞嘧啶五号碳上的甲基基团。在小鼠中，Tet1在PGC中高度表达，对于种系特异性基因的去甲基化和维持印记是必需的。此外，Tet3大量存在于受精卵中，起到介导小鼠早期胚胎DNA主动去甲基化的作用。然而，牛胚胎中DNA去甲基化是否由TET蛋白催化发生，具体哪一个家族成员在牛早期胚胎发育的去甲基化过程中起主导作用，以及Tet基因和牛

6、胚胎早期发育的相关性等内容一无所知。本研究首先利用荧光定量的方法检测了卵母细胞以及IVF植入前胚胎的Tet家族成员的表达量，结果发现在牛植入前胚胎中只有Tet2和Tet3被检测到。与Tet3的表达量相比，Tet2的表达量相当低，这表明在牛早期胚胎发生重编程的过程中，Tet3起到了主要的作用，而不是Tet1和Tet2。我们采取利用TET酶抑制剂（DMOG）来阻止TET3酶活性的策略，来研究TET3蛋白对牛早期胚胎发育的影响。1mMDMOG的处理明显增加了牛不同发育阶段胚胎的5mC水平。同时，卫星DNA和多能性基因启

7、动子的DNA甲基化水平显着增加。实时PCR分析结果表明Nanog的转录水平在DMOG处理组中显著降低。此外，TET蛋白的抑制会影响囊胚形成，导致囊胚率下降（17.1±1.3％VS24.1±0.6％），根据TUNEL染色的结果，囊胚阶段内细胞团凋亡的百分比显著增加。另外，凋亡相关基因Bax的表达水平上调，而Bcl-2的表达下调。这些结果支持了TET3蛋白通过影响DNA甲基化重编程、基因表达和细胞凋亡进而在牛早期胚胎发I育中起到重要作用。自从第一个克隆动物Dolly诞生以来，体细胞核移植（SCNT）在多种哺乳动物物种

8、中取得了成功。牛作为一种重要的家畜在我国具有重要的经济价值，SCNT技术在牛上得到了长期的应用，效率却一直很低。SCNT低效率的主要原因之一是供体细胞核中DNA甲基化重编程的不完全，导致胚胎发育期间异常的基因表达。我们欲采取在牛胎儿成纤维细胞中过表达Tet3基因，然后利用这种稳定表达的细胞系作为供体细胞进行牛的体细胞核移植的策略，来提高对供体细胞的DNA甲基化重编程，以此