急性肝衰竭肝性脑病模型中TNF-α对脑组织氨转运体表达的影响

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1、分类号：R575.3单位代码：10159密级：公开学号：201110215博士学位论文中文题目：急性肝衰竭肝性脑病模型中TNF-α对脑组织氨转运体表达的影响英文题目：EffectofTumorNecrosisFactor-alphaonExpressionofAmmoniaTransportersinBrainTissueofmousewithAcuteHepaticEncephalopathy论文作者：王文指导教师：刘沛教授学科专业：感染病学完成时间：2018年10月1中国医科大学博士学位论文急性肝衰竭肝性脑病模型中TNF-α对脑组织氨转运体表达的影响Effec

2、tofTumorNecrosisFactor-alphaonExpressionofAmmoniaTransportersinBrainTissueofmousewithAcuteHepaticEncephalopathy论文作者王文指导教师刘沛教授申请学位医学博士培养单位第一临床学院一级学科临床医学二级学科内科学研究方向急性肝衰竭发病机制论文起止时间2013年7月—2018年10月论文完成时间2018年10月中国医科大学（辽宁）2018年10月23中国医科大学博士学位论文摘要目的：急性肝衰竭（ALF）可由多种原因引起的一种综合征，表现为大量肝细胞坏死及（或）严重

3、肝功能障碍，短期内患者可发生肝性脑病。ALF是严重危害人类健康的疾病。肝性脑病（HE）是ALF晚期最常见的致死性并发症，其发病机制迄今尚未完全阐明，目前已提出多种学说。其中高血氨被认为是最关键的因素之一。氨是一种弱碱，在生理性pH7.4时，氨发生质子化，98%以上以NH+4的形式存在。游离的NH3是脂溶性的，可以被动通过细胞膜。近年研究发现，氨的转运，除了伴随着浓度梯度的被动扩散之外，还有NH+4/NH3的主动转运蛋白参与其中。哺乳动物中的氨转运蛋白，即Rhesus相关糖蛋白是近年来研究较多的氨转运体，尤其RhBG/Rhbg和RhCG/Rhcg在肾脏氨分泌中的作用

4、已通过基因敲除等实验得出初步结论。而ALF导致的HE中，尚不清楚脑组织中是否存在NH+4/NH3的主动转运蛋白。本研究通过建立ALF所致肝性脑病小鼠模型，利用蛋白免疫印迹及RT-PCR等方法，初步探讨氨转运体是否参与了肝性脑病时氨引起的中枢神经系统毒性。TNF-α在多种病因导致的急性肝衰竭的发生中有重要作用，这在患者及实验模型中都得到证实。近年研究显示TNF-α与HE的发生机制密切相关，有研究显示，TNF-α增加氨在中枢神经系统源性内皮细胞的扩散，增加脑内的氨浓度，增加氨的中枢神经系统毒性。本研究通过观察ALF所致的肝性脑病小鼠模型中TNF-α水平变化以及阻断TN

5、F-α后脑组织氨转运体蛋白及mRNA的表达变化，探讨TNF-α是否介导了氨通过血脑屏障进入中枢神经系统引起肝性脑病的过程。BBB由大脑毛细血管内皮细胞及其紧密连接复合物组成。BBB是一层连续覆盖在99%脑毛细血管腔表面的内皮细胞膜。本研究通过培养人脑微血管内皮细胞（HBMEC），并加入人TNF-α，观察TNF-α对于HBMEC中氨转运体表达的直接作用，初步探讨TNF-α影响脑组织氨转运体表达的机制。I中国医科大学博士学位论文材料与方法实验动物为C57BL/6小鼠，随机分为8组。1组：生理盐水对照组（0h）；2组：D-GalN300mg/Kg对照组；3组：LPS对照

6、组；4组：D-GalN+LPS组；5组：D-GalN+TNF-α组；6组：TNF-α对照组；7组：D-GalN600mg/Kg对照组；8组：抗TNFαIgG抗体组（抗TNFαIgG抗体+D-GalN+LPS）。1组为0小时组，2-5组分为5个时间点（2h、6h、9h、12h、24h），6-8组以12小时为观察时间点。每个时间点5只存活小鼠，留血、肝组织和脑组织待检。1、应用生化学方法检测小鼠血清中的ALT水平，并对肝组织进行HE染色，明确肝细胞坏死的程度和生化学改变。2、利用氨检测试剂盒，检测脑实质氨及血氨水平。3、利用ELISA法检测血清TNFα水平。4、应用W

7、esternBlot方法对脑组织氨转运体Rhbg、Rhcg的蛋白表达作半定量分析。5、应用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）方法对脑组织氨转运体Rhbg、RhcgmRNA的表达作相对定量分析。6、应用免疫组化和免疫荧光法观察小鼠脑组织Rhcg表达部位。结果1、急性肝衰竭小鼠模型的建立D-GalN+LPS组小鼠注射后，出现懒动，摄水和觅食动作减少，6小时ALT水平明显升高，6h死亡率28%（18/65），9h及12h的肝组织学表现为出血性的亚大块或大块坏死，24h死亡率达60%。使用TNFα代替LPS与D-GalN联合注射后，小鼠出现以上相似的表现、ALT及肝脏

8、组织学改变