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1、层析技术基本原理内容•层析术语•凝胶过滤层析•离子交换层析•疏水作用层析•亲和层析层析（Chromatography）的历史液体输送系统进样系统层析柱检测&自动收集系统1906-MikhailSemenovichTswett(1872-1919)植物色素分离:碳酸钙吸附剂/石油醚3/GE/五大层析原理GelFiltrationIonExchangeHydrophobicReversedAffinityinteractionphase分子筛离子交换亲和疏水层析反相OSOO4/GE/重要的术语和参数•分离体积•分辨率•选择性•柱效•对称性•线性流速•载量5
2、/GE/分离体积•VR•Vo•Vt•Vc•Vo=外水体积•VR=保留体积/洗脱体积•Vt=总液体体积•Vi=内孔体积/内水体积•Vc=柱体积•Vs=固相凝胶的体积6/GE/分辨率：分离峰的能力凝胶过滤可得到15个峰反相液相峰>150个•0•10•20ml•0•200•400•ml注意：我们不是在纯化峰，而是纯化生物分子7/GE/分离系数RsRs=0.6Rs=1Rs=4V-V21R=s(W+W)/212两峰相对于其峰宽而言,分开的有多远分辨率取决于选择性和有效性（柱效）选择性:高选择性•峰分离的量度•高选择性可以达到基线分离低选择性•高选择性可以弥补低的
3、柱效-峰体积有可能增加有效性（柱效）:高柱效•峰宽的量度•柱效越高峰越窄低柱效•高柱效需要良好的柱填装技术•高柱效有时可弥补选择性不足峰展宽的影响因素(轴向扩散）(传质阻力)(涡流扩散)大分子大颗粒填装差不规则峰宽峰宽峰宽小分子小颗粒填装好流速流速流速增加流速降低流速不规则的填料涡流扩散填料粒径分布&柱装填质量流速对峰宽的影响峰宽传质阻力涡流扩散轴向扩散流速层析速率方程•H=Ad+B/u+Cd2uppH:等板高度,d:粒径,u:linearflow线速度Ad:eddy,ppB/u:diffusionalongcolumn,Cd2u:masstransf
4、erp柱效测定方法VoVsVi测试样品:1%柱体积丙酮（浓度1%）或者氯化钠对称性AsAU280bA=saA=1峰最好的形状sabwidthsatAs>1峰拖尾10%heightA<1峰前倾sVrA：0.8~1.5可接受的范围S线性流速线性速度：流速流体前沿沿柱管单位时间向下的柱高(ml/min)(cm)迁移距离(cm/hr)Flow(ml/min)x60线性流速(cm/hr)=2CrossArea(cm)载量(吸附层析)Flow流速MasstransferBeadssurface&innerporesBulk填料表面和内孔溶液主体载量取决于:蛋白性
5、质-分子量,形状,带电性,疏水性等填料性质-性质,粒径大小,配基等操作条件-pH,盐浓度,添加剂,蛋白浓,温度,流速内容•层析术语•凝胶过滤层析•离子交换层析•疏水作用层析•亲和层析18/GE/什么是凝胶过滤层析凝胶过滤层析：是根据分子的大小来分离生物分子的一种简单可靠的层析技术。•根据大小和形状分离•非吸附方式•只需一种缓冲液•容易操作19/GE/凝胶过滤填料的结构Agarose琼脂糖凝胶•孔内充满洗脱液•孔径精密控制•基架化学惰性，耐受常见溶剂•cross-linkedagarose•基架具有一定的机械强度•dextran•基架不能吸附生物分子
6、Cross-sectionfromSuperdexparticle20/GE/作用原理12341.装填在柱子里的球状填料.出峰顺序2.上样.3.缓冲液携带着样品通过层析柱，分子在填料孔径内来回扩散.4.大分子先流出层析柱，小分子后出.怎么去做----知道分子量大小和差异目的物和杂质分子量差别一倍以上•mAU•dimer•1500•1000•monomer•500•0•0.0•5.0•10.0•15.0•20.0•25.0•ml怎么去做----选择合适填料•Superdex™:首选的分子筛凝胶−选择性高,快速,可放大•Sephacryl™HR−规格齐全、
7、经济有效聚集体去除,小规模•Superose™−分离范围广•Sepharose™−病毒/DNA/多糖等−大分子纯化•Sephadex™−快速脱盐，置换缓冲液，去除试剂怎么去做----选择合适填料怎么去做----选择合适的层析柱分析和微量制备型制备型•Superdex™PC3.2/30•Superdex10/300GL•Superose™•Superose•HiLoad™•HiLoadPC3.2/3016/60010/300GL26/600SuperdexpgSuperdexpg•Superdex•HiPrep™•HiPrep分辨率5/150GL16/6
8、026/60Sephacryl™Sephacryl•Note:Deadvolumeinthes
