层析技术概述y

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1、层析技术概述（生物化学与分子生物学专业）摘要：本文对层析技术的概念、分类以及各种层析方法的原理、基本操作进行了概述。关键词：层析技术；概念；分类；原理1层析技术的概念层析技术（Laycr-analisctechnique）,就是利用样品屮各组成成分的不同物理化学性质的差异，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相两相中，由于各组分随流动相前进的速率不同，从而把它们分离开来的技术。这些物理特性包括分子的大小、形状、所带电荷、挥发性、溶解性及吸附性质等。层析系统的必要组分有：a.固定相，可以是一种固体、凝

2、胶或固定化的液体，由某种支持基质所支撑。b.层析床，把固定相填入一个玻璃或金属柱屮，或者薄薄涂布一层于玻璃或塑料片上或者吸附在醋酸纤维纸上。c.流动相，起溶剂作用的液体或气体，用于协助样品平铺在固定相表面及将其从层析床中洗脱下來。d.运送系统，用来促使流动相通过层析床。e.检测系统，用于检测试管中的物质。2层析技术的分类按照操作形式和层析原理的不同，层析技术可分为纸层析、薄层层析和离子交换层析、凝胶层析等种类。本文重点介绍了生物化学分离中常用的几种层析方法：2・1纸层析（paper-chromato

3、graphy）纸层析是以滤纸作为支持物的分配层析，在分析鉴定氨基酸上应用佼多。滤纸纤维与水有较强的亲和力，能吸收22%左右的水，其小6%〜7%的水是以氢键形式与纤维素的羟基结合。由于滤纸纤维与有机溶剂左右的亲和力很弱，故而在层析吋，以滤纸纤维及其结合的水作为固定相，以有机溶剂作为流动相。纸层析对混合物进行分离时，发生两种作用：第一种是溶质在结合于纤维上的水与流过滤纸的有机相进行分配（即液一液分离）；第二种是滤纸纤维对溶质的吸附及溶质溶解于流动相的不同分配比进行分配（即固一液分配）。在实际操作中，点样

4、后的滤纸一端浸没于流动相液面之下，由于毛细管作用，有机相即流动相开始从滤纸的一端向另一端渗透扩展。当有机相沿滤纸经点样处时，样品中的溶质就按各自的分配系数在有机相与附着于滤纸上的水相之间进行分配。一部分溶质离开原点随着有机相移动，进入无溶质区，此时又重新进行分配；一部分溶质从有机相进入水相。在有机相不断流动的情况下，溶质就不断地进行分配，沿着有机相流动的方向移动。因样品屮各种不同的溶质组分有不同的分配系数，移动速率也不一样，从而使样品小各组分得到分离和纯化。可以用相对迁移率（Rf）來表示一种物质的迁

5、移，Rf值是定性分析的重要指标。在样品所含溶质较多或某些组分在单相纸层析中的Rf比较接近，不易明显分离时，可采用双向纸层析法。该法是将滤纸在某一特殊的溶剂系统屮按一个方向展层以后，即予以干燥，再转向90°,在另一溶剂系统中进行展层，待溶剂到达所要求的距离后，取出滤纸，干燥显色，从而获得双向层析谱。应用这种方法，如果溶质在第一溶剂中不能完全分开，而经过笫二种溶剂的层析能得以完全分开，大大的提高了分离效果。纸层析还可以与区带电泳法结合，能获得更有效的分离方法，这种方法称为指纹谱法。2.2薄层层析（thi

6、n・layerchromatography,TLC）薄层层析是在玻璃板上涂布一层支持剂，待分离样品点在薄层板一端，然后让推动剂从上流动，从而使各组分得到分离的物理方法。常用的支持剂有：硅胶G、硅胶GF、氧化铝、纤维素、硅藻土、硅胶G硅藻土、纤维素G、DEAE-纤维素、交联葡•聚糖凝胶等。使胶层析等多种。用的支持剂种类不同,其分离原理也不尽相同，有分配层析、吸附层析、离子交换层析、凝一般实验中应用较多的是以吸附剂为固定相的薄层吸附层析。物质之所以能在固体表面停留，这是因为固体表面的分子和固体内部分子所

7、受的吸引力不同。在固体内部，分子Z间互相作用的力是对称的，其力场互相抵消。而处于固体表明的分子所收的力是不对称的，向内的一面受到固体内部分子的作用力大，而表面层所受的作用力小，因而气体或溶质分子在运动中遇到固体表面时受到这种剩余力的影响，就会被吸引而停留下来。吸附过程是可逆的，被吸附物在一定条件下可以解吸出来。在单位吋间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡，称为吸附平衡。吸附层析过程就是不断地产生平衡和不平衡、吸附与解吸的动态平衡过程。薄层层析设备

8、简单，操作简单，快速灵敏。改变薄层厚度，既能作分析鉴定，乂能做少量制备。配合薄层扫描仪，可以同时做到泄性是量分析，在生物化学、植物化学等领域是一类广泛应用的物质分离方法。2.2离子交换层析(ionexchangechromatography)离子交换层析是利用离子交换剂上的可交换离子与周围介质屮被分离的各种离子间的亲和力不同，经过交换平衡达到分离的目的的一种柱层析法。该法可以同时分析多种离子化合物，具有灵敏度高，重复性、选择性好，分离速度快等优点，是当前最常用的层析法