级工技一班吕满枝吴伟岸张日兴

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09级工技一班吕满枝吴伟岸张日兴“创新与实践”华南师范大学生命科学学院第七届生物化学实验技能大赛参赛作品紫苏油的提取及其对大蒜SOD活性探讨 一、实验题目紫苏油的提取及其对大蒜SOD活性探讨二、摘要本次试验主要通过对紫苏油的提取，通过不同浓度的紫苏油对大蒜SOD活性的影响，得出最适合浓度。对现实生活中大蒜和紫苏混合吃法提供依据，在化妆品添加SOD的方面提供新思路。三、实验目的对紫苏油进行提取，并研究其对大蒜SOD活性影响。 四、实验材料及试剂大蒜细胞SOD酶液，紫苏籽，正己烷，蒸馏瓶，试管，碳酸缓冲液0.05mol/L，EDTA溶液0.1mol/L，蒸馏水，肾上腺素液0.5mol/L，离心机，分光光度计 五、实验操作步骤5.1紫苏油的提取用搅拌机将50g苏籽研成末状，放入蒸馏瓶中，加入正己烷100mL,于55℃恒温，回流1h,过滤、蒸馏可以得到深黄色油状液。 5.2大蒜细胞SOD的提取5.2.1SOD的提取取30g左右的大蒜蒜瓣，用搅拌机打碎并加入2倍~3倍的0.05mol/lpH7.8的磷酸缓冲液，搅拌10min，使SOD充分溶解到缓冲液中，然后3000r/min离心15min，弃沉淀，得提取液。 5.2.2除杂蛋白提取液加入0.25倍体积的氯仿-乙醇混合溶剂搅拌15min，3000r/min离心15min，去杂蛋白沉淀，得粗酶液。5.2.3SOD的沉淀分离将上述酶液加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，3000r/min离心15min，得SOD沉淀。将SOD沉淀溶于0.05mol/LpH7.8的磷酸缓冲液中，得到SOD酶液。 5.3紫苏油对大蒜SOD活性研究取5根小试管，分别加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL的紫苏油，再同时加入0.6mL大蒜细胞SOD酶液，充分振荡5min，再静止5min，重复操作30min。待其分层。按下表加入试剂空白管对照管样品1样品2样品3样品4样品5样品6碳酸缓冲液5.05.05.05.05.05.05.05.0EDTA溶液0.50.50.50.50.50.50.50.5蒸馏水0.50.5原酶液0.5处理后酶液0.50.50.50.50.5混合均匀肾上腺素液0.50.50.50.50.50.50.5 在加入肾上腺素前，充分摇匀并在30°C水浴中预热5min。加入肾上腺素，然后立刻测定各管480nm的光密度。每30s读一次数，读10min。结果与计算：SOD抑制肾上腺素自氧化的50%所需的酶量定义为一个酶活力（单位）。即：酶活力（单位）=[2×(A对照-A样品)×N]/A对照式中：N——样品稀释倍数；2——抑制肾上腺素自氧化50%的换算系数（100%/50%）A——自氧化速率 实验数据 管号对照1号2号3号4号5号6号时间光密度光密度光密度光密度光密度光密度光密度0.54.0004.0004.0004.0004.0004.0004.0001.04.0004.0004.0004.0004.0004.0004.0001.54.0004.0004.0004.0004.0004.0004.0002.04.0004.0004.0004.0004.0004.0004.0002.54.0004.0004.0004.0004.0004.0004.0003.01.5774.0004.0004.0004.0001.7484.0003.51.1034.0002.4114.0004.0001.4204.0004.00.8984.0001.6424.0004.0001.2274.0004.50.7852.2471.3713.1112.7001.0994.0005.00.7221.7521.2262.0831.8130.9964.0005.50.6801.4721.1351.5621.4730.9151.9076.00.6521.3131.0731.3431.2940.8471.5156.50.6381.1851.0301.2201.1810.7961.3247.00.6291.0940.9971.1371.0950.7571.2097.50.6171.0190.9701.0781.0400.7261.1318.00.6090.9780.9491.0380.9960.7031.0778.50.6020.9420.9331.0040.9690.6851.0369.00.5970.9210.9210.9780.9430.6701.0049.50.5880.8970.9090.9560.9220.6600.98210.00.5810.8870.8970.9360.9050.6490.962空白管0.0000.0010.0000.0000.002-0.0010.001 结果分析曲线并没有在1min后出现线性相关，而是在30s的时候就达到了最大的吸光值，而且平均持续了3min左右。在平均3min后，光密度开始急速下降，在6~10min开始平缓下降. 从实验原理来看，肾上腺素在碱性条件下先自氧化释放出O2.-随后生成红色的肾上腺素红(R)这时溶液颜色变成淡红色。肾上腺素红在空气中并不稳定，会进一步氧化成其它化合物，此时溶液的颜色由淡红转为黄色。因此，要求我们测定时间严格控制在初始阶段，在这段时间内，肾上腺素红的积累在滞后一分钟左右后与时间基本成线性关系 问题分析我们在查阅资料后发现：影响肾上腺素自氧化因素很多，其中pH、肾上腺素的浓度、温度尤为重要。我们认为肾上腺素的浓度过大是导致实验失败的主要原因。 新的改进方法将pH10.2,50mmol/L的Na2CO3-NaHCO3缓冲液在30℃±0.5℃水浴中保温20min，取2.9mL加入到1cm比色杯中，然后注入100uL1.2mmol/L肾上腺素(终浓度0.4mmol/L)，在325nm波长处测定自氧化速率，每隔30s读取OD值，连续读取14min，以时间对光密度作图。