酶活实验方案

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1、酶的提取:取不同发育时期决明了幼芽根、茎、叶或幼芽各lg于预冷的研钵中，加lml预冷的磷酸缓液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为2ml。取2ml于4°C1000(k/min离心20min上清液即为酶粗提液。过氧化物酶(POD)活性的测定(比色法)一、原理：过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中。在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，此产物在470nm处冇最大光吸收值，故可通过测470nm下的吸光度变化测定过氧化物酶的活性。(1)100mmol/L磷酸缓冲液(pII=6.

2、0)：[0.2MWNa2HP0412.3mL^NaH2P0487.7mL混合后稀释2倍](2)反应混合液:100inmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)50ml于烧杯中,加入愈创木酚28u1,于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧化氢191x1,混合均匀，保存于冰箱屮。四、操作步骤取光径lcni比色杯2只，于1只屮加入反应混合液3讥和磷酸缓冲液lmL(或加热煮沸5min的酶液)，作为校零对照，另1只屮加入反应混合液3ml,上述酶液lml(如酶活性过高可稀释Z),立即开启

3、秒表记录时间，于分光光度计上在波长470nmF测量吸光度值，每隔0.5min(30S)读数一次，连续读数3次。五、，亠M-l、I△AnoXIt过氧化物酶活性(ug•mm丿一•单位(U)WXI：X0.01xt式小：ZAA470——反应时间内吸光度的变化；W——植物鲜重(g)；t反应时间(min)；VT提取酶液总体积(mL)；Vs——测定时取用酶液体积(mL)。六、注意事项酶液的的提取过程要尽量在低温温条件下进行。H2O2要在反应开始前加，不能直接加入。氮蓝四哇(NBT)法测定超氧化物歧化酶(SOD)活

4、性一、实验目的1、了解氮蓝四哩(NBT)法测定植物体内超氧化物歧化酶(SOD)活性的基本原理。2、掌握氮蓝四U坐(NBT)法测定植物体内超氧化物歧化酶(SOD)活性的基本操作方法。二、实验原理超氧化物歧化酶(s叩eroxidedismutase,SOD)普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四啤(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性大小。在冇氧化物质存在下，核黄素可被光述原，被述原的核黄素在冇氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离了口由基，超氧阴离了门由基

5、可将氮蓝四呻还原为蓝色的甲腺，后者在560nm处冇最人吸收。而SOD口J清除超氧阴离子自曲基，从而抑制了甲腺的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。三、试剂(1)0.05mol/L磷酸缓冲液(pH7.8)。91.5ml0.05MNa2HP04+8.5ml0.05MNaH2PO4。(2)130mmol/L甲硫氨酸(Met)溶液:称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至lOOmL(3)750pmol/L氮蓝四哩溶液：称取0.06133gNBT用

6、磷酸缓冲液定容至100ml,避光保存。(4)100pmol/LEDTA-Na2溶液：称取0.03721gEDTA-Na2,用磷酸缓冲液定容至1000mlo(5)20pmol/L核黄索溶液：称取0.0753g核黄索用蒸馆水定容至1000ml,避光保存。四、实验步骤1、显色反应取10mL试管(要求透明度好)4支,2支为测定管，另2支为对照管，按下表加入各种溶液:表1（）SOD沽性卿定的试刑量试管编号1对照（不光S3）2对照（光照）34缓冲液（mL）3.503.503.503.50甲硫氨酸（mL）0.50

7、0.500.500.50氮蓝四呼（mL）0.500.500.500.50EDTANa2(mL)0.500.500.500.50蒸馆水（mL）0.500.500.400.40酶液000.100.10核黄素0.500.500.500.50测定结果0AckAeiAe2表11SOD活性测定（平行测定2次）的Abs试管号2对照（光照）34平行测定次数第一次第二次第一次第二次第一次第二次吸光度A（Abs）0.2030.2510.0550.1990.0350.140各溶液显色反应用量混匀后将1支对照管置暗处，其他

8、各管于40001汨光下反应20min（要各管受光情况一致，温度高，时间缩短，低时延长）。2、SOD活性测定与计算至反应结朿后，全部移入暗处，以不照光的对照管作空白，分别测定其他各管的吸光度。注意：用放在暗处的缓冲液代替酶液的空£1管调零，各试剂按比例混合好（3.5ml缓冲液+0.5ml甲硫氨酸+0.5ml氮蓝四卩坐+0.5mlEDTANa2+0.40ml蒸纟留水），再加100ul酶液，核黄素0.5ml最后单独加入。总体积6.0mL五、结果计算计算公式：SOD(U/g.