测定纤维素酶活实验方法总结及优化方案

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1、DNS法测定酶活实验方法总结及优化方案目前纤维素酶没有统一的测定方法，诸多因素影响纤维素酶酶活测定大小的比较。选择适宜的酶活测定条件，提高测定结果的准确性，可根据有关资料中采用的测定条件，以及通过控制变量法对酶活力测定中的主要影响因素进行研究。目前实验室采用测酶活方法：1、葡萄糖标准曲线制作：试管号1234561mg/ml葡萄糖标准液/ml00.10.20.30.40.5蒸馏水量/ml0.50.40.30.20.10葡萄糖浓度/mg/ml00.20.40.60.81PH4.8磷酸氢二钠-柠檬酸/ml1.51.51.51.51

2、.51.5DNS试剂/ml333333沸水浴7min后快速冷却加入蒸馏水/ml555555530nm比色。2、酶活测定方法：管号空白管0样品管1样品管2酶液/ml0.50.50.5沸水灭活10min1%CMC-Na/ml1.51.51.545℃下反应30min，沸水灭活10minDNS试剂/ml333沸水浴中7min显色快速冷却后蒸馏水/ml555考虑到酶液中培养基成分会对吸光值造成一定的影响，所以空白管0还是采用先将酶高温灭活的方法，后面保持实验条件一致，显色时间与标准曲线的显色时间保持一致。单位酶活的计算：n：稀释倍数；

3、K：曲线斜率；T：反应时间，min；1000：mg换算成ug.以下是近期所做的实验结果：葡萄糖标准曲线两种产纤维素酶细菌不同测试结果浓度mg/ml吸光值总酶活（10ml）单位酶活浓度mg/ml吸光值总酶活（10ml）单位酶活R2上清（未破碎）0.2290.12566776.457727.645772183上清（未破碎）0.4020.22133.851713.385170.2390.13066779.49987.949980.4050.222135.068513.506850.4260.233333141.963914.196

4、390.43833330.24146.0214.602R2破碎（无缓冲未离心）183破碎（无缓冲未离心）0.3840.21128.37612.83760.45466660.249151.495815.14958R2破碎（无缓冲取上清）0.3070.167667102.011210.20112183破碎（无缓冲取上清）0.4270.234142.369514.236950.3120.170667103.836510.383650.4430.243147.845314.78453R2破碎（1：1缓冲取上清）0.21566660.

5、11871.793197.179319183破碎（1：1缓冲取上清）0.2090.11569.967946.9967940.25166660.13883.961528.3961520.16166660.08954.14915.41491测定结果实验结论：从以上几种对酶液的处理方法来看，183的酶活要比R2高，两种菌都是以胞外酶为主。目前尚没找到有关于加缓冲溶液并且超声破碎的文献，所得测量结果与前面三种方法均不符，这一步需另外探索。根据《纤维素酶活力测定条件研究》（夏服宝等，《饲料工业》2005年第26卷第16期）和《影响纤维

6、素酶活力测定的几个因素》（刘妙莲等，中国食品发酵工业研究所）这两篇文献，实验室可先从底物浓度、温度、DNS用量、显色时间以及对菌体的超声破碎时间这几方面进行探索，进而优化实验方法。刚果红染色法：常用的刚果红染色法有两种，一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，另一种是在倒平板时就加入刚果红。方法一在长出茵落的培养基上，覆盖质量浓度为1mg／mI。的CR溶液，10～15min后，倒去CR溶液，加入物质的量浓度为lmol／I。的NaCI溶液，15min后倒掉NaCl溶液，此时，产生纤维素酶的茵落周围将会出现透明圈。方法二配

7、制质量浓度为10mg／mI。的CR溶液，灭菌后，按照每200mI。培养基加入1mI。的比例加入CR溶液，混匀后倒平板。等培养基上长出茵落后，产生纤维素酶的菌落周围将会出现明显的透明圈。两种刚果红染色法的比较刚果红在筛选纤维素分解菌上的应用已经有超过20年的历史，课本中给出了两种方法。方法一是传统的方法，缺点是操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂；其优点是这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。方法二的优点是操作简便，不存在菌落混杂问题，缺点是由于在纤维素粉和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶

8、的微生物出现假阳性反应。但这种只产生淀粉酶的微生物产生的透明圈较为模糊，因为培养基中纤维素占主要地位，因此可以与纤维素酶产生的透明圈相区分。方法二的另一缺点是：有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会降解刚果红而形成明显的透明圈，与纤维素分解菌不易区分。测酶活的方法主要有这两