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1、植物组织中超氧化物歧化酶（SOD）,过氧化物酶（POD），过氧化氢酶（CAT），丙二醛（MDA），和可溶性蛋白质的测定酶液制备lg样品叶片剪碎放入研钵，加入2ml0.05MpH7.8的PBS（磷酸缓冲液）及少量石英砂，冰浴研磨，匀浆倒入10ml离心管，再加3mlPBS于研钵冲洗研钵后倒入离心管，15000转下离心5min，上清液为酶提取液，取上清液?ml,移入10ml容量瓶中，用PBS定容。1SOD的测定⑴0.05M磷酸缓冲液配定方法设磷酸二氢钠，磷酸氢二钠浓度分别为cl,c2mol/Lo由题意,cl+c2=0.05再根据
2、•缓冲溶液ph计算公式;：pH=pKa+lg（c碱/c酸）可得7.2+lg（c2/cl）=7.8其屮7.2是磷酸二氢根的pKa值，7.8是溶液的pH值。联立解得cl=0.01,c2=0.04所以磷酸二氢钠质S为0.01*120.0=1.20克磷酸氢二钠质量为0.04*142.0=5.68克称取1.20克无水磷酸二氢钠（或1.38克一水磷酸二氢钠，1.56克二水磷酸二氢钠｝和5.68克无水磷酸氢二钠（或10.72克七水磷酸氢二钠，14.32克十二水磷酸氢二钠），置于烧杯中，加少量蒸馏水溶解。固体全部溶解后，将溶液转移到100
3、0毫升容量瓶屮。用蒸馏水润洗溶解用的烧杯三次，润洗后的水也加入到容量瓶屮,定容，即得。（2）130mMMET（甲硫氨酸）:取1.9399gMET用磷酸缓冲液定容至100ml。棕色瓶避光rc保存。（3）750uMNBT（氮蓝四唑）:取0.06133gNBT用磯酸缓冲液定容至100ml。棕色瓶避光4°C保存。⑷100uMEDTA-Na2:取0.03721EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。棕色瓶避光保存。（5）20uMMFD（核黄素）:0.00753MFD用蒸馏水定容至1000ml。棕色瓶避光保存。反应液PBS(PH
4、7.8)50mM1.5mlMET（甲硫氨酸）130mM0.3mlNBT（氮蓝四唑）750uM0.3mlEDTAlOOuM0.3mlMFD（核黄素）20uM0.3ml酶液50ul蒸馏水0.25ml共3ml,30°C,40001ux光照15min,560nm比色。对照，空白不加酶液（加50umPBS7.8）,空白暗处下放置;每个试验重复3次（3试验+3空白+3对照）560™测定各管光密度值2MDA的测定lml酶提取液+反应混合液，沸水浴20min,冷却，1500转离心lOmin,测定532,600nm波长下比色。混合液配制TC
5、A（三氯乙酸）101.25g+TBA（硫代巴比妥酸）2.5g,加热溶解，定容至500ml,试验时4ml混合液加lml酶提取液即可。2POD的测定在试管中依次加入4ml0.3%愈创木酚（0.02MpH6磷酸缓冲液配罝），50ul酶液，50ul0.3%HA,摇匀，立即计时，lmin后在470nm波长下比色，每lmin记录—次吸光度值，连续记录5min,以每分钟内A470变化0.01为一个过氧化物酶活性单位（U）0.02MpH6磷酸缓冲液配置取2.964g二水磷酸二氢钠和2.592g十二水磷酸氢二钠置于烧杯中，加少量蒸馏水溶解。
6、固体全部溶解后，将溶液转移到1000毫升容量瓶中。用蒸馏水润洗溶解用的烧杯三次，润洗后的水也加入到容量瓶中，定容，即得。取10ml试管3支，管号酶提取液（ml）3CAT活性测定其中2支样品测定管，一支为对照空白，按下表加入试剂SoSiS20.20.20.2PBS(ml)1.51.51.5蒸馏水（ml）1.01.01.0将S。号管在沸水浴煮，lmin以杀死酶液，冷却。然后将所有试管在25°C下预热后，逐管加入0.3ml0.lmol/1的H202,每加完一管立即计时，并迅速倒入石英比色皿中，在240nm下测定吸光度，每隔lmi
7、n读数一次，共测定4min，待3支管全部测完，计算酶活。5可溶性蛋白测定（1）标准蛋闩质溶液：100ug*Ml-l牛血清蛋白：称取牛血清蛋白25mg,加水溶解并定容至100ml,吸取上述溶液40ml,用蒸馏水稀释至100ml即可。（2）5mlG-250考马斯亮蓝+25ul酶提取液，2min后在595nm下比色，G-250配罝，100mgG-250加50ml95%乙醇溶解后，加100ml85%磷酸后用水定容至1000ml。贮于棕色瓶中，常温下可保存一个月。（注：酶液用量要适宜，pr含量过低时再多加入，否则比色记出负数）方法：
8、1.标准曲线的绘制取6支具塞试管，按表加入试剂，混合均匀后，向各管中加入5ml考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀，并放置5min左右，在595nm下比色测定吸光度。以蛋白质浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。管号123456标准蛋白（ml）00.20.40.60.81.0蒸馏水1.00.80.60.
