柠檬酸摇瓶发酵及提取byLeMon

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1、柠檬酸摇瓶发酵及提取生技08-2班L3eMon小组廖维华刘露刘豫宁麻佳佳实验目的：1、学习掌握柠檬酸液体发酵工艺2、了解柠檬酸提取工艺3、增强团队协作能力柠檬酸：C6H8O7物化性质：白色结晶粉末，无臭。熔点(℃),153℃。味极酸，在潮湿的空气中微有潮解性。它可以以无水合物或者一水合物的形式存在：柠檬酸从热水中结晶时，生成无水合物；在冷水中结晶则生成一水合物。加热到78℃时一水合物会分解得到无水合物。加热至175°C时它会分解产生二氧化碳和水，剩余一些白色晶体。所以，柠檬酸提取过程中，温度控制很重要。分子式：实验原理高度亲水性实验原理柠檬酸发酵为典型的有机酸发酵，

2、淀粉质原料经淀粉酶作用水解为葡萄糖，葡萄糖经EMP途径氧化为丙酮酸，丙酮酸进一步被氧化脱羟生成乙酰CoA，就一般能量代谢过程而言，生成的乙酰CoA与草酰乙酸缩合成柠檬酸后进入三羟酸循环，通过三羟酸循环进行有氧呼吸的能量代谢。但就柠檬酸产生菌（黑曲霉菌）而言，在实验pH下，其顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶活性很低，而柠檬酸合成酶的活性很高，因而大量积累柠檬酸。柠檬酸的发酵的过程80%的糖代谢走EMP途径黑曲霉中存在TCA的酶系柠檬酸发酵的条件1、合适的碳源（淀粉、麦芽糖、甘露糖等），高浓度的糖；2、合适的pH值，黑曲霉在pH为2～3的环境中发酵糖，产物以柠檬酸为主；当pH

3、接近中性时则大量产生草酸，而柠檬酸产量很低；3、发酵液中溶氧量要高（摇床的转速200r/min）。生产菌种：黑曲霉Aspergillusniger半知菌亚门，丝胞纲，丝孢目，丛梗孢科，曲霉属。真菌中的一个常见种。生长适温37℃，最低相对湿度为88%柠檬酸产量最高的菌种。且能利用多样化的碳源。生产方法：深层液体发酵法发酵周期短，产率高，节省劳动力，占地面积小，便于实现仪表控制和连续化实验流程斜面发酵培养基接种补糖4d,28℃提取（马铃薯葡萄糖琼脂培养基）（摇床）（每48h补一次）2C6H8O7·H2O+3CaCO3→Ca3(C6H5O7)2·4H2O+3CO2↑+H2

4、O中和终点pH:6.0～6.8温度：50～70℃菌液过滤中和酸解过滤脱色去金属离子浓缩结晶Ca3(C6H5O7)2·4H2O+3H2SO4+4H2O→2C6H8O7·H2O+3CaSO4·2H2O，85℃在此温度下各种变体石膏的溶解度均最小），并有利于形成片状的半水石膏，便于过滤加热至80～90℃加热的作用：终止发酵；使蛋白变性凝固，降低发酵液黏度；使菌体中的柠檬酸释放活性炭，1～3%，85℃，搅拌30min强酸型阳离子交换树脂50～60℃，常压浓缩易分解成乌头酸，且结晶色泽变深提取工艺流程1、菌种：黑曲霉Aspergillusniger2、培养基：PDA(马铃薯葡

5、萄糖琼脂)培养基,发酵培养基(土豆200g煮汁、蔗糖20g、NH4NO32g，KCl0.15g，MgSO40.25g，水1000ml；pH=5)3、器材：三角瓶2个，棉塞2个，纱布若干，接种环，小烧杯，水浴加热锅，离心机，离心管，PH试纸，电子天平，滤纸，大试管,电炉（加石棉网）,摇床,玻璃棒，无菌tip头，移液枪，碱式滴定管，电子显微镜4、试剂：无菌水，酚酞，0.1429～0.1430mol/LNaOH溶液，CaCO3，10%H2SO4，40%蔗糖溶液实验器材实验步骤2、发酵培养基配制及分装（以实验室为单位）配方：土豆200g煮汁、蔗糖20g、NH4NO32g，K

6、Cl0.15g，MgSO40.25g，水1000ml；pH5（总糖100g/L；基础20g/L+补糖80g/L）分装：每小组2瓶，每瓶100ml；棉塞或8层纱布；0.08Mpa，20min3、制备孢子悬液及接种（以小组为单位）向每支斜面菌种加入5ml无菌水，用接种环刮菌苔表面或用无菌tip头轻轻吹打制备孢子悬液；将悬液接入灭菌并冷却至室温的培养基。注：勿接入过多孢子，否则菌丝过于浓密，影响产酸和后处理中的过滤4、摇瓶发酵、补料及参数检测摇瓶条件：200rpm，32℃；发酵4天补料：发酵48h补糖，每瓶（100ml）加入灭菌40%蔗糖液27ml。参数检测：接种后每24

7、h取样测定、记录发酵液pH。5、发酵液酸度测定酸度—是指100ml发酵液所含柠檬酸的克数。酸度测定方法：取发酵液滤液或离心液1ml，以酚酞为指示剂，用0.1429～0.1430mol/L标准NaOH溶液滴定至淡粉红色，所消耗的NaOH毫升数即为发酵液酸度。（通过对柠檬酸酸度的测定，可以推出从葡萄糖到柠檬酸的转换率。）6、柠檬酸提取（部分）1）2C6H8O7·H2O+3CaCO3→Ca3(C6H5O7)2·4H2O+3CO2↑+H2O2）Ca3(C6H5O7)2·4H2O+3H2SO4+4H2O→2C6H8O7·H2O+3CaSO4·2H2O3）浓缩结晶C6H8O