胰岛素、催乳素对奶山羊乳腺上皮细胞泌乳功能的影响

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1、http://www.paper.edu.cn胰岛素、催乳素对奶山羊乳腺上皮细胞泌乳功能的影响佟慧丽，高学军*，李庆章东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨(150030)E-mail：tonghuili2004@163.com摘要：具有泌乳功能的乳腺上皮细胞可用于乳腺定位表达载体的评估，并可作为乳腺生长发育及泌乳功能调控机制研究的细胞模型。本研究对已建立的关中奶山羊乳腺上皮细胞系的泌乳功能进行评价。结果表明：在添加表皮生长因子、胰岛素样生长因子-1、转铁蛋白-硒钠、标准胎牛血清的DF12培养液中乳腺上皮细胞具有乳脂、乳蛋白及乳糖的分泌能

2、力。胰岛素处理48h对细胞的泌乳功能无显著影响，催乳素处理细胞48h后可诱导体外培养的奶山羊乳腺上皮细胞乳蛋白、乳糖分泌能力的显著升高。关键词：胰岛素；催乳素；乳腺上皮细胞；泌乳功能中图分类号：Q21．引言原代培养的乳腺细胞保持了特异性的功能和信号转导途径，能最有效的代表体内状态。影响乳腺细胞生乳的激素种类很多,但主要也是催乳素,肾上腺糖皮质素及胰岛素。胰岛素、[1]糖皮质激素和催乳素对乳蛋白mRNA的积累具有重要作用。一般来说，体外培养的乳腺上皮细胞的乳蛋白尤其是酪蛋白的合成均需要催乳素的作用，胰岛素和糖皮质激素可加强催乳素的作用，但不是必须

3、的。近年来激素对乳腺上皮细胞功能影响的研究逐渐深入，且越来越趋向于泌乳细胞信号转导与分子机制的研究，如催乳素受体激活STAT5/JAK细胞信号途径介[2-5]导的乳腺泌乳调控机制的研究。[6]有泌乳功能的乳腺上皮细胞系既可以用来研究乳蛋白基因表达及乳汁分泌机制，又可以作为研究干乳期细胞凋亡及乳腺退化的宝贵材料。同时还可以作为乳腺特异性表达载体的[7]检测系统,评价乳腺特异性表达载体的有效性及合理性。本研究旨在建立一个具有泌乳功能的奶山羊乳腺上皮细胞系，建立药物作用及泌乳功能调控机制的体外研究模型。通过对乳腺上皮细胞系乳脂、乳蛋白及乳糖的分泌情况

4、对乳腺上皮细胞的功能进行评价，探索催乳素、胰岛素诱导的乳腺上皮细胞的泌乳机能。从而为动物乳腺发育和泌乳功能机制的研究提供一定的实验依据。2．材料与方法2.1材料和仪器①实验材料:原代培养的关中奶山羊乳腺上皮细胞系。②主要试剂:表皮生长因子，转铁蛋白-硒钠、胰岛素样生长因子、胰岛素、催乳素，Sigma公司；优质胎牛血清、DF12培养基，Gibco公司；甘油三酯（TG）试剂盒购自北京北化康泰试剂公司；乳糖标准品购自天津军事医学科学院。其他常规实验药品及试剂均为国产。③主要仪器：ZHJH-1112垂直流超净工作台(上海智城分析仪器制造有限公司）；CO

5、-150型CO2培养箱(日本)；SZ-93自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)；DFC280倒置相差显微镜(德国LEICA)；SBA系列生化分析仪（赛诺迈德医学技术有限责任公司）；高效液相色谱仪LC-10AT(日本岛津，SPD-10A紫外检测器)。-1-http://www.paper.edu.cn2.2实验方法2.2.1奶山羊乳腺上皮细胞的培养选用健康关中奶山羊的乳腺组织块，通过胶原酶和透明质酸酶组和消化法获得原代培养的奶山羊乳腺上皮细胞，利用乳腺上皮细胞与成纤维细胞对胰蛋白酶敏感性的不同，通过选择性传代获得纯化的乳腺上皮细胞。通过细胞的

6、持续传代和反复冻存及复苏，建立了正常培养的关中山羊乳腺上皮细胞系，细胞传至30代仍保持增殖活力。2.2.2奶山羊乳腺上皮细胞的激素处理选择对数生长期的关中奶山羊乳腺上皮细胞，用0.25%胰酶-0.02%EDTA消化细胞，终止消化，轻轻吹打，制成单细胞悬液，等密度接种于6孔板中，待细胞铺满培养底壁的70%~80%时，向含10%FBS的DF12培养液中添加表皮生长因子、转铁蛋白-硒钠和胰岛素样生长因子，以此作为对照组。在此培养液成分的基础上分别添加5µg/ml胰岛素、5µg/ml催乳素作用于体外培养的奶山羊乳腺上皮细胞，分别称为胰岛素处理组和催乳素

7、处理组。继续培养48h后对细胞进行消化并收集细胞，以研究奶山羊乳腺上皮细胞乳脂、乳蛋白、乳糖的分泌能力。2.2.3乳腺上皮细胞总蛋白的SDS-PAGE电泳收集不同组分处理后的细胞，以1:5的比例加入含蛋白酶抑制剂的匀浆缓冲液，匀浆器机械破碎细胞，-4℃，14000rpm，离心10min，上清用于SDS-PAGE。Ⅰ12％分离胶制备：30％丙烯酰胺4.0ml，0.5MTris-HCl(pH6.8）2.5ml，10％SDS100µl，10％APS50µl，TEMED5µl，dH2O3.4ml；Ⅱ5％浓缩胶的制备：30％丙烯酰胺1.7ml，0.5MT

8、ris-HCl(pH8.8）2.5ml，10％SDS100µl，10％APS50µl，TEMED10µl，dH2O5.7ml；Ⅲ样品准备：将样品与2×