《基因工程药物》PPT课件

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1、第1章基因工程药物重点：制备基因工程药物的基本过程不能忘记的人1953年4月25日，英国《自然》杂志发表了沃森和克立克的文章“核酸的分子结构—DNA的一个结构模型”。标志着DNA双螺旋结构的建立，从此，遗传学和生物学的历史从细胞阶段进入了分子阶段。不能忘记的人FSangerWGilbertSanger（英国化学家）最早测定胰岛素的氨基酸顺序获得1958年诺贝尔化奖。22年后，他因测定了一种噬菌体的一级结构获1980年的诺贝尔化学奖。Gilbert在DNA测序领域，因其卓越的工作获得1980年诺贝尔化学奖。不能忘记的人PaulBergBerg（美国生物化学家）通过

2、把两个不同来源的DNA连结在一起并发挥其应有的生物学功能，证明了完全可以在体外对基因进行操作。他作为“重组DNA技术之父”于1980年获诺贝尔化奖。不能忘记的人KaryBMullis1985年穆利斯发明了高效复制DNA片段的聚和酶链式反应（PCR）技术，利用该技术可从极其微量的样品中大量生产DNA分子，使基因工程获得了革命性发展。基因工程技术外源基因的筛选、合成技术基因工程的核心内容是对不同来源的DNA进行重组。1、基因组文库：物理或酶切法将染色体DNA降解，然后插入到载体内，再转入宿主细胞内，许多宿主细胞一起组成含有基因组各个DNA片段的集合体。优点：信息全面

3、。缺点：工作量大（尤其是基因组较大时）基因组DNA文库限制性内切酶基因组DNA基因重组转化细菌体外包装鸟枪法（shotgun）10基因工程技术2、cDNA文库：真核细胞具有内含子和外显子。以mRNA为模板经过反转录酶合成与mRNA互补的DNA序列，再复制成双链DNA与载体连接转入受体细胞，构建cDNA文库。优点：较基因组文库小，筛选目标相对简单。cDNA文库的组建：基因重组反转录酶mRNAcDNA逆转录法就是分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成cDNA，然后进行cDNA克隆表达。123、PCR技术PCR技术：1985年由美国Cetus首创，可以将微量目的DNA

4、片段扩增一百万倍以上。优点：敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便能够，比较容易地对目的基因进行分析、鉴定。获1993年诺贝尔化学奖。PCR的原理：用于扩增位于两段已知序列之间的DNA片段，类似于天然DNA的复制过程。以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5′末端和3′末端互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。变性：加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链。退火(复性):降温后模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，也存在两条模

5、板链之间的结合，但由于引物的高浓度，结构简单的特点，主要的结合发生在模板与引物之间。55℃30″3.延伸：将反应温度调节到酶的最适温度，在DNA聚合酶、4种dNTPs等存在的条件下，以引物的3′端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的新DNA链。上述3步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～40个循环后DNA可扩增106～109倍。PCR的基本反应步骤变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚C双链DNA分子双链断开循环1模板与引物结合循环1TaqTaq循环1TaqTaq循环1循环1双链断开循环2模板

6、与引物结合循环2TaqTaqTaqTaq循环294℃变性双链断开循环3循环3TaqTaqTaqTaqTaqTaqTaqTaq循环3循环n基因工程技术4、DNA的人工化学合成目前常用的有磷酸二酯法、磷酸三酯法、固相亚磷酸三酯法。合成片段较小、价格昂贵。基因工程技术基因克隆酶学基础1、限制性内切酶外切酶：从核酸的一端把核苷酸水解下来的酶内切酶：从核酸链中间通过水解3’-5’磷酸二酯键切断核酸链的酶。其中某些内切酶只能识别专一核酸序列并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶，。主要功能是限制外源DNA的存在33/35EcoliK株噬菌体EcoliK株其他Ecol

7、i菌株限制现象微生物的噬菌体不能交叉感染，如EcoliK株的噬菌体只能感染EcoliK株，不能感染其他株，反之亦然。这种现象称为“限制现象”。34/35限制性内切酶能识别并切断外来DNA分子的某些部位，使外来DNA失去活性，限制外来噬菌体的繁殖。35/35细菌能将外来的DNA片段在某些专一位点上切断，保证其不为外来噬菌体所感染，而自身的染色体DNA由于被一种特殊的酶所修饰而得以保护。此酶在5'GATC3'序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基，使一些识别顺序中含有5'GATC3'的限制性内切酶不能切割来自大肠杆菌的DNA。此酶在序列5‘CCAGG3’或5‘CCTGG3

8、’中的胞嘧啶C5上引入甲