用包埋脱水法冰冻保存海洋饵料金藻 王起华李 贺=张恩栋高艳萍李大鹏

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1、第36卷第2期海洋与湖沼Vol.36，No.22005年3月OCEANOLOGIAETLIMNOLOGIASINICAMar.，2005用包埋脱水法冰冻保存海洋饵料金藻*王起华李贺=张恩栋高艳萍李大鹏==1）（辽宁师范大学生命科学学院大连116029）（=大连民族学院生物工程系大连116600）=（=中国科学院海洋研究所青岛266071）提要用包埋脱水法冰冻保存绿色巴夫藻（Pavlovaviridis）、湛江等鞭金藻（Isochrysiszhanjian-gensis）和球等鞭金藻（Isochrysisgalbana3011）等三

2、种海洋饵料金藻，探讨了脱水速率、胶球含水量以及化冻后恢复方法对冰冻保存存活率的影响。结果表明，三种藻都在-0.9%含水量/h的平均脱水速率下获得最高存活率。各种藻在冰冻前的胶球最佳含水量不同，绿色巴夫藻为35%，湛江等鞭金藻和球等鞭金藻都为30%。化冻后，含绿色巴夫藻的胶球在培养基中22℃暗放置48h存活率最高；另两种藻在相对湿度为75%的气相中22℃暗放置12h存活率最高。在本实验条件下，绿色巴夫藻、湛江等鞭金藻和球等鞭金藻的冰冻保存的存活率可分别达到74%、15%和17%。关键词包埋脱水法，冰冻保存，含水量，脱水速率，恢复方法

3、中图分类号Q33海洋饵料微藻在鱼、虾、贝类育苗生产中有着脱水法研究了脱水速率、胶球含水量和化冻后恢重要作用，有关其超低温保存的研究近年来日益复方法对绿色巴夫藻（Pavlovaviridis）、湛江等鞭受到重视（Canavateetal，1995；Dayetal，1993；金藻（Isochrysiszhanjiangensis）和球等鞭金藻马志珍等，1997；王起华等，1999，2000a）。以往（Isochrysisgalbana3011）等几种海洋饵料金藻超低微藻的保存方法多采用常规的两步冰冻法，在预温保存的影响。冻过程中需要严

4、格控制降温速率，要求特殊的设1材料与方法备和技术，而且大多使用对生物材料有害的抗冻1.1材料保护剂，限制了该技术的广泛应用（Scottezetal，绿色巴夫藻（Pavlovaviridis）、湛江等鞭金藻1992；王起华等，2002）。20世纪90年代初，一种（Isochrysiszhanjiangensis）和球等鞭金藻（Isochrysis新的保存技术———包埋脱水法在高等植物种质的galbana3011）藻种由辽宁师范大学藻类生理实验冰冻保存中得以建立并广泛应用。该法操作简室提供，在含100mlf/2培养基的250ml三角烧

5、瓶单，不需复杂设备，而且通常不使用抗冻保护剂，中培养，培养条件为22℃、光强55这无疑是对超低温保存技术的一个重大发展µmolphoten/（m2·s）、光周期L:D=12:12。（Fabreetal，1990；王君晖等，1999）。近年来采用该方法保存某些藻类已获得初步成功（Dayet1.2包埋和脱水al，2000；Hirataetal，1996；Vigneronetal，1997；1.2.1包埋取静止初期的藻细胞作为实验王起华等，2000b），表明包埋脱水法在藻类种质材料，离心去除培养液后用消毒海水悬浮至约冰冻保存中具有一定的

6、应用潜力。作者采用包埋8细胞/ml，与含30‰NaCl的6%褐藻酸1.08×10*国家自然科学基金资助项目，30170099号、30470184号；辽宁省教育厅基金资助项目，20041015号；中国科学院知识创新工程资助项目，ZKCX2-211号。王起华，教授，E-mail：qihuamail@163.com1）通讯作者：李大鹏，博士，研究员，E-mail：dpli@ms.qdio.ac.cn收稿日期：2003-12-26，收修改稿日期：2004-04-272期王起华等：用包埋脱水法冰冻保存海洋饵料金藻173钠（SIGMACHEM

7、ICALCO.）溶液等体积混匀，移入率则迅速下降。可见，脱水速率过低和过高，都不具6号针头的10ml注射器中。将藻液滴入含利于冰冻保存，绿色巴夫藻的最佳平均脱水速率30‰NaCl的0.1mol/LCaCl2溶液中，轻轻摇动，固为-0.9%含水量/h（图1）。湛江等鞭金藻和球等定30min后完成包埋过程，胶球直径约为3mm。鞭金藻（图2a、b）与绿色巴夫藻有相似之处，它们方法参照王起华等（2000b）。的最佳平均脱水速率也都是-0.9%含水量/h（含1.2.2脱水及含水量的测定取上述胶球30水量为30%）；当脱水速率低于或高于-0.

8、9%含个称鲜重后，在22℃暗室内用硅胶吸湿法按每小水量/h时，冰冻前的存活率的变化情况也相似。时含水量减少0.9%的平均脱水速率脱水至指定不同之处有两点：一是湛江等鞭金藻和球等鞭金含水量后，测定脱水后的胶球重量和胶球干重，并藻冰冻后的存活率远远低于