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1、用包埋脱水法冰冻保存小新月菱形藻1213王起华,李莹,刘艳萍,李大鹏(1.辽宁师范大学生命科学学院,辽宁大连116029;2.辽阳职业技术学院师范分院,辽宁辽阳111000;3.中国科学院海洋研究所,山东青岛266071)摘要:采用包埋脱水法研究了小新月菱形藻(Nitzschiaclosteriumminutissima)的超低温保存,探讨了影响存活率的内、外因素:藻细胞年龄、脱水速率、胶球含水量和化冻后的恢复方法等。结果表明,将处于静止初期的藻细胞包埋在含有0.5mol/L蔗糖的3%褐藻酸钙胶球中,以含水量每小时减少0.9%的平
2、均速率脱水至胶球含水量为40%,化冻后在冻存管中室温下暗恢复12h的条件下冰冻存活率较高,可达到18.3%左右。与常规的两步法冰冻保存相比,包埋脱水法可大大简化操作程序,是保存小新月菱形藻的一种有潜力的方法。关键词:小新月菱形藻(Nitzschiaclosteriumminutissima);包埋脱水法;冰冻(超低温)保存中图分类号:Q33文献标识码:A文章编号:100023096(2006)0420050204海洋饵料微藻在鱼、虾、贝类育苗生产中有着重1.2包埋和脱水要作用,有关其超低温保存的研究近年来日益受到1.2.1包埋[1
3、～6]重视。然而,以往的保存方法多采用常规的两步取上述培养材料,离心除去培养液,用含0.5[7]冷冻法,限制了该技术的广泛应用。20世纪90年mol/L蔗糖的消毒海水再悬浮至适当密度,与含0.5代初,包埋脱水法在高等植物种质的冷冻保存中得mol/L的蔗糖和30‰NaCl的6%褐藻酸钠(SIGMA以建立并广泛应用。该法操作简单,不需复杂设备,CHEMICALCo.)溶液等体积混匀,移入具6号针头而且通常不使用抗冻保护剂,是对超低温保存技术的10mL注射器中,将藻液滴入含相同浓度的蔗糖[8]的一个重大发展。近年来采用该方法保存某些藻和
4、NaCl的0.1mol/LCaCl2溶液中,轻轻摇动,60[9～12]类已获得初步成功。但是,采用该法保存海洋min后完成包埋过程。控制条件可制成直径为2.5[13]饵料微藻的研究尚鲜有报道,作者曾尝试用包埋4mm,藻密度为200×10个/球的胶球。此方法参照脱水法冷冻保存牟氏角刺藻并取得了初步成功。作文献[13]。者用包埋脱水法研究了藻细胞年龄、脱水速率和胶1.2.2脱水及含水量的测定球含水量对另一种海洋饵料硅藻———小新月菱形藻将上述胶球放置在22℃暗室中,用硅胶吸湿法超低温保存的影响,并在此基础上进一步探讨了化脱水。除特殊说
5、明外,以每小时含水量减少0.9%的冻后恢复方法对小新月菱形藻和牟氏角刺藻冷冻保脱水速率脱水至40%含水量后测定胶球的含水量,存的影响。[13]方法参照李莹等。1材料和方法1.3冰冻和化冻胶球脱水后立即采用一步冰冻法快速冰冻,保存1.1材料及其培养[12]24h后采用快速化冻法化冻,方法参照王起华等。小新月菱形藻(Nitzschiaclosteriumminutis2sima)由大连水产研究所提供,并由辽宁师范大学藻类生理研究室纯化为单种。藻种的培养条件为18℃收稿日期:2004202225;修回日期:2004208210±2℃;冷
6、荧光,光强2500lx±200lx,光照周期基金项目:国家自然科学基金资助项目(30170099,30470184);12∶12。实验材料的培养光强为2900lx±200lx,辽宁省教育厅科研基金资助项目(20041015)其他条件同前。牟氏角刺藻(Chaetocerosmuelleri)作者简介:王起华(19432),男,辽宁北宁人,教授,主要从事的培养条件见文献[13]。除特殊说明外,取培养10d藻类生理和生物技术研究,E2mail:qihua_mail@163.com;的材料(静止期)用于冰冻保存。李大鹏,通讯作者,E2ma
7、il:dpli@ms.qdio.ac.cn50MarineSciences/Vol.30,No.4/20061.4化冻后的恢复究结果基本一致,即脱水速率显著影响冰冻后材料化冻后的胶球采用下述3种方法恢复:(1)将胶的存活率。不同的是,如前所述,脱水速率对小新月球移入f/2培养基中;(2)将胶球移入直径3cm的培菱形藻冰冻前的存活率影响很小,而对杜氏藻冰冻前养皿中,将培养皿分别置于含有过饱和盐(KNO3、的存活率影响较大。本实验结果与作者冰冻保存牟NaCl和NaNO2)溶液的密闭玻璃罐的上部气相中,氏角刺藻的实验结果[13]都表明,
8、脱水速率是影响冰其相对湿度(RH)分别为KNO3,92%;NaCl,75%;冻存活率的重要因素之一,应该给予更大的重视。NaNO2,64%;(3)将胶球保留在密封的冻存管中。上述处理都是在22℃暗中进行,除特殊说明外,恢复时间都是12h。1.5存活
