微生物保存——冷冻真空干燥保存法03

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1、微生物保存一一冷冻真空干燥保存法03冷冻真空干燥保藏法1、原理冷冻干燥保藏菌种法可克服简单保藏方法的不足。利用有利于菌种保藏的一切因素，使微牛物始终处于低温、干燥、缺氧的条件下，因而它是迄今为止最有效的菌种保藏法之一。保藏菌种范围广、时间长、存活率高。主要步骤为：①将待保藏菌种的细胞或抱子悬液悬浮于保护剂（如脱脂牛奶）中；②在低温（-45°C左右）下使微生物细胞快速冷冻；③在真空条件下使冰升华，以除去大部分的水。2、材料菌株待保藏的各种菌种。试剂2%HCI；脱脂牛奶（20%乳液）、50%甘油。器具培养皿

2、、5mlEP管、接种环、大三角瓶、高压蒸汽灭菌锅、牛皮纸、酒精灯、恒温培养箱、振荡培养箱、离心机、酒精棉球、安咅瓦管、标签、移液枪、普通棉、、冻干机。培养基：LB液体培养基、LB固体平板培养基。3、主要流程备安甑管一备脱脂乳一制菌悬液一分装一预冻一真空干燥一封管保藏4、操作方法4.1准备安甑管安甑管先用2%HCI浸泡过夜，再用水洗多次，用蒸憾水冲洗三次，烘干。管口塞上棉花，用牛皮纸包扎，灭菌备用。（121°C灭菌30min）4.2制备脱脂乳使用脱脂奶粉配兑脱脂牛奶，配成20%乳液，灭菌（112°C灭菌5

3、min）,并做无菌试验后备用。4.3制菌悬液①平板划线：将活化后的菌株用接种环进行平板划线，对菌种进行纯化。倒置37°C恒温培养过夜。②增菌培养：挑取单个菌落接种于液体培养基（3ml左右）中，振荡培养。③甘油保存:菌液：甘油=0.75:0.75ml的比例,对菌株进行甘油保存（2管）。④离心：将EP管放入离心机中进行离心，去掉培养基。⑤配菌悬液：将lml无菌脱脂牛奶直接加到离心后的EP管内，轻轻搅乱使其均匀地悬浮在牛奶内成悬浮液。一般要求制成的菌液浓度达108^1010个为宜。4.4分装用移液枪将悬浮液分

4、装入安甑管底部，每支安甑管的装量约为0.2毫升（需4管）塞上棉花，并贴上标签。4.5预冻将分装好的安甑管在冰箱冷冻室进行预冻。4.6真空干燥预冻以后，将安甑管放入真空器中，开动真空泵进行干燥。（冻干机的使用方法）4.7封管封管前将安甑管装入歧管；真空度抽至1.33Pa（0.01毫米汞拄）后,再用火焰熔封，封好后，要用高频火花器检查各安甑管的真空情况。如果管内呈现灰蓝色光，证明保持着真空。检查时高频电火花器应射向安甑管的上半部。采用酒精喷灯，封管。4.8保藏做好的安甑管应放置在低温避光处保藏。（4°C冰箱

5、保藏）5注意事项（1）安甑瓶不易进水，清洗时拿少量安甑瓶慢慢倾斜，使其管内浸入盐酸；用蒸锚水洗时亦如此；塞棉花时注意松紧适宜。（2）脱脂乳最好在使用头一天配制好灭菌；灭菌需注意温度不能过高，在112°C灭菌10分钟即可；当压力降为0后，应尽快将其拿出，防止高温破坏英营养成分（灭菌后颜色发生变化的不可用）。（3）对菌液进行离心前，因质量不等，需对管进行称重，用水进行配平。（4）离心后倒培养基需十分注意，防止将沉淀的细菌倒掉。（5）倒入脱脂牛奶后，需要枪头将菌悬液混匀。（6）分装时，需至少三个人配合，一个吸

6、菌液，另一个塞棉花，还有一个贴标签。（7）采用酒精喷灯进行封管时，烧的温度要适宜。1株细菌：2管甘油保存（1.5ml50%甘油），4管安甑瓶保存（1ml脱脂牛奶）即需要:1/4平板，1个5mlEP管,3mlLB培养基,2个1.5mlEP管，4个安甑瓶，1.5ml50%甘油,1ml脱脂牛奶，4个标签