基因工程次重点

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1、第一章生物技术的特点：高效益、高智力、高投入、搞竞争、高风险、高势能高新技术：生物技术、信息技术、新材料技术、新能源技术、空间技术、海洋技术基因工程三大基本元件：供体、受体、载体基因工程的理论依据：1.不同基因具有相同的物质基础2.基因是可切割的3.基因是可以转移的4.多肽和基因Z间存在对应5.遗传密码是通用的6o基因可通过复制把遗传信息传给下一代基因工程原理的三大基石：分子遗传学、分子生物学、生物化学工程学基因工程的支撑技术：核酸凝胶电泳技术、核酸分子杂交技术、细菌转化转染技术、DNA序列分析技术、寡核昔酸合成技术、基因定点突变技术、聚合酶链反应技

2、术第一个被发现并应用的限制性核酸内切酶：HiM11基因工程诞生时间（建立DNA重组技术）：1973-Cohen&Boyer第一个基因工程药物：人生长激素释放抑制激素（基因工程成熟阶段）第一个基因工程药物上市：重组人胰岛素第一个转基因动物：超级硕鼠第一个转基因植物：转基因烟草第一个基因工程疫苗：乙肝疫苗第一个单克隆抗体药物：抗CD3单抗0KT3第二章II型限制酶主要特性：单功能、同源二聚体、驱珥4-6bp旋转对称回文结构、识别序列内或两侧特异性切割限制酶识别序列出现的频率：n碱基对的识别序列在DNA上出现的频率为l/4n题1：勿/门识别序列为GATC,

3、其在DTA上出现的频率为1/4",即任何一个DNA分子上，平均每256bp中就会出现1个勿〃I切口。识别序列为4、5、6碱基对的II型酶分别有20、30、50种。题2：DNA链上出现1个II型酶识别序列的概率约为1/9（20X1/44+30X1/45+50X1/46）,即任何1个DNA分子上，平均每9bp中就会出现1个II型酶切口。完全同裂酶：识别序列和酶切位点完全相同（〃加dITT和HsuT）不完全同裂酶：识别序列相同，但酶切位点不同（XnigI和5）〃日I）同尾酶：有些限制酶虽识别序列不同，但酶切产生的DNA片段具有相同末端和加cl）杂种位点：由

4、一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点（一般不能被原来的任何-种同尾酶识别，称为“焊死”）Eco"存在两种DNA甲基化酶:DNA腺嚓吟甲基化酶（Dam）、DNA胞U密呢甲基化酶（Dem）影响限制酶活性的因素：1.底物DNA分子：DNA的分子结构（空间构象、侧面序列、位点偏爱）、DNA的甲基化程度（采用甲基化酶失活突变的质粒）、DNA的纯度（加大酶量、加大反应体积、延长反应时I'可、重新重提高纯度DNA）2.限制酶用量（限制酶通常保存于50%甘油中，贮存于-20°Co）3.反应缓冲液（MgCl2>NaCKTris-HCKDTT或卩-ME、BSA

5、）4.反应温度和时间：不同限制酶的最适反应温度不同，大多数是37°C限制酶的星号活性：限制酶在非标准反应条件下，对识別序列的特异性下降，能切割一些与特异识别顺序类似的序列星号活性产生的原因：1.酶与底物DNA比例过高：＞100U/gg.2.高浓度甘油：＞5%v/v3.低离子强度：＜25niM4.用其它二价阳离子替代Mg2+：Mn2+、Zn2+、Co2+等1.高pH值:＞8.02.含有机溶剂：DMS0、乙醇、乙烯二乙醇等3.酶切时间过长抑制星号活性的方法：1.使用尽量少的酶2.酶量不应超过反应体积的10%邙艮制酶贮存于50%的廿油中）.3.尽量使用推荐

6、的缓冲液4.使用Mg2+作为反应所需的二价阳离子5.尽量避免有机溶剂（如制备DNA时引入乙醇）污染6.使用尽量短的时间完成酶切导致部分酶切的原因：1.DNA样品纯度低.2.识别序列甲基化3.酶用量不足4.反应缓冲液不适宜5.反应温度不适宜6.反应时间不够产生匹配粘端方式：同一限制酶切割、同尾酶切割产生平端方式：限制酶切割、RNA逆转录合成的cDNA为平端双链、PCR扩增提高平端连接效率的方法：1.加大连接酶用量（10倍于粘端连接，1-2U）2.加大平端DNA片段的浓度3.加入10%PEG80004.加入单价阳离子（NaCl）,终浓度150-200mM

7、E・coliDNA聚合酶I:5'-＞3'DNA聚合酶活性;5'-3'核酸外切酶活性;3'-5'核酸外切酶活性（较低）用途：缺刻平移法制备同位素标记的DNA探针Klenow酶：5'-3'DNA聚合酶活性3'-5'核酸外切酶活性（较低）失去5'-3,核酸外切酶活性用途：1.补平由限制酶酶切产生的5'突出粘端2.DNA片段的同位素末端标记.3.合成cDNA第二链4.双脫氧末端终止法测定DNA序列T4DNA聚合酶：5'7聚合酶活性,3'-5'核酸外切酶活性（比Klenow高200倍）4种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位无dNTP时,从3'-0H端外切只有

8、1种dNTP时，外切至互补核苛酸暴露时停止用途：1.切平由限制酶酶切产生的3'突出粘端1.取代合成法进行DN