基因工程 考试重点

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1、1.简述基因工程四大要素的作用及基因工程操作步骤目的基因、运载体、工具酶、受体细胞1.获取目的基因2.基因表达载体的构建（即目的基因与运载体结合）3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因导入受体细胞后，检测与鉴定是否可以稳定维持和表达其遗传特性2.构建cDNA基因文库基本过程是怎样的a.细胞总RNA的提取和mRNA分离b.第一链cDNA合成c.第二链cDNA合成d.双链cDNA克隆进质粒或噬菌体导入宿主细胞进行繁殖3.基因工程中常用的酶类有哪些，有何作用限制性核酸内切酶基因的剪刀连接酶连接DNA分子聚合酶合成DNA分子修饰酶甲基化酶4.基因工程在

2、生产实践中有何应用农业：抗逆性转基因植物农药生产医学：基因诊断基因治疗抗生素环境：环境监测净化污染5.关于转基因生物的争论　　（1）转基因生物可能对环境质量、生态系统或生态系统的稳定性产生不利影响。（2）转基因生物可能对人体健康产生不利影响，严重的可以致癌和其他遗传病。（3）基因武器可能给人类带来毁灭性的危险。6.影响DNA连接反应的因素有哪些连接缓冲液pHATP浓度连接温度与时间酶浓度DNA浓度7.重组子的筛选与鉴定有哪些方法遗传检测法（平板筛选）分子检测法（PCR）物理检测法（电泳）免疫化学检测法核酸序列分析8.目的基因制备方法从细胞核中直

3、接分离限制性内切酶酶解人工体外合成逆转录酶制备cDNA9.重组DNA技术中最常用的运载目的基因的载体是什么常用的运载体主要有两类:一类是质粒,它是存在于细菌或酵母菌细胞质中的一类小型环状DNA分子,结构简单,独立于染色体或拟核之外,具有自我复制能力.另一类是病毒,包括植物病毒动物病毒噬菌体10.基因工程的克隆载体必须具备的条件？ （1）有复制起点（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点（3）具备合适的筛选标记（4）具备合适的拷贝数目（5）分子量要相对较小（6）在细胞内稳定性要高（7）易分离纯化11.λ载体的克隆原理和步骤1、通过裂解过程增殖λ

4、载体。2、载体与外源DNA的酶切。载体一般要纯化左路、右臂，并进行去磷酸化处理。3、外源DNA与载体的连接，形成的是多联体。4、重组噬菌体的体外包装，需要单独制备衣壳蛋白，包装过程对DNA大小有选择性。5、包装后的噬菌体颗粒感染大肠杆菌，经过λ的复制、包装和裂解过程，重组载体得到扩增，一个λ的感染和扩增会导致它周围一圈范围内的大肠杆菌被溶解，形成透明的溶菌圈/噬菌斑。6、筛选。每个噬菌斑代表了一个重组λ，所有噬菌斑的集合就为一个文库。12.受体细胞应具备的条件是什么？ 1、便于重组DNA分子的导入。2、便于重组体的筛选。根据所用的表达载体所含的

5、选择性标记与受体细胞基因是否相匹配，从而易于对重组体进行筛选。3、遗传稳定性高，易于进行扩大培养或易于进行高密度发酵而不影响外源基因的表达效率。对动物细胞而言，所选用的受体细胞具有对培养的适应性强，可以进行贴壁或悬浮培养，可以在无血清培养基中进行培养。4、受体细胞内内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低，利于外源蛋白表达产物在细胞内积累，可促进外源基因高效分泌表达。5、安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染。一般选用致病缺陷型的细胞或营养缺陷型细胞作为受体细胞6、能使重组DNA分子稳定存在于细胞中。从受体细胞的角度出发，通常的做法是是对其

6、作适当的修饰改造，如选用某些限制性核酸内切酶缺陷型的受体细胞就可以避免其对重组DNA分子的降解破坏作用。7、受体细胞在遗传密码子的应用上无明显偏倚性。8、具有较好的转译后加工机制等，便于真核目的基因的高效表达。9、在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。13.天然DNA来源:①染色体DNA。②病毒和噬菌体DNA。③质粒DNA。④线粒体和叶绿体DNA。14.转基因技术的几个主要步骤？ （1）分离能够编码所需产物的DNA片段 （2）将目的基因克隆到适当的载体DNA中形成重组DNA，并且连接了一个控制目的基因转录表达的启动子和一个控制目的基因转录终止

7、的终止子，还连接了一个标记特殊蛋白质的标记基因 （3）利用细菌繁殖扩增重组DNA  (4)利用基因枪、农杆菌等方法将连接了启动子和终止子的目的基因导入到目标植物的细胞中 （5）筛选含有外源基因的转化细胞，并诱导产生转基因植株 （6）转基因植株大规模种植。15.目的基因与启动子拼接后，重组分子若不表达，应如何分析？A.目的基因的表达方式分：细胞内表达或者分泌产物至细胞外，如果蛋白为分泌性，那么细胞内检测不到表达，或者表达很少； B.分子量大小，分子量大小决定了蛋白半衰期，因而检测需要延长； C.目的基因的抗体特异性不好则很难以检测表达； D.许多

8、表达宿主自身有自己的蛋白酶，会将所需产物降解，也可能因为修饰系统不同，使得产物的活性不高或者没有； E.如果宿主菌与蛋白来源菌不同也有可能由于密码子使