基因工程重点总结

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1、第一章绪论1、重组DNA技术：是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。4、基因工程的基本操作程序（P7）（1）.从供体生物的基因组中分离获取带目的基因的DNA片段（2）限制性核酸内切酶将含有外源DNA和载体分子切开(3)DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段连接到载体分子上，形成DNA重组分子(4)将重组DNA分子

2、引入到受体细胞（5)带有重组体的细胞培养拓增，获得大量的细胞繁殖群体（6）筛选和坚定转化细胞，获得使外源基因高效稳定表达的记忆工程菌或细胞(7）将选出的细胞克隆的目的基因进一步演剧分析，并设法使之实现功能蛋白的表达第二章基因工程的工具酶一、限制性核酸内切酶P15：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4—8bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶hsdR：编码限制性核酸内切酶hsdM：编码限制性甲基化酶hsdS：表达产物协助酶识别特殊的作用位点。1、粘性末端的意义P①连接便利i）不同的D

3、NA双链只要粘性末端碱基互补就可以连接。ii）同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。②5’末端标记凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。③补平成平齐末端粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。2、同裂酶：是不同来源分离出来的不同酶，但具有相同的识别顺序，切割DNA的方式可以相同，也可不同。如XmaI和SmaI3、同尾酶：它们是不同的酶，但切割后可产生相同的粘性末端，因

4、此同尾酶的切割片断之间可以相互连接，这种酶在分子生物学中有较大的价值。4、远距离裂解酶：这类酶的识别位点与切割位点不一致，它们在某一核苷酸区域与识别顺序结合，然后滑行到识别顺序以外的另一个位点进行切割。5、可变酶：这类酶是II型酶中的一个特例，它们的识别顺序中的1个或几个核苷酸是可变的，并且其识别顺序—般大于6个碱基对。6、II型限制性核酸内切酶酶解注意事项①浓缩的酶应该用缓冲溶液稀释，稀释后应尽快用完；②保存在50%甘油中，-20度条件下；③酶切反应的时候，最后加酶；④酶从冰箱中取出后应该放置于冰上或

5、者冰盒上；⑤酶应该分成小份，避免反复冻融；⑥取酶要用新的灭菌的吸头，避免污染；⑦加酶的体积不要超过反应体系的1/10。7、影响限制性核酸内切酶活性的因素①DNA样品的纯度蛋白质、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS等解决方法：加大酶的用量，1mgDNA用10U酶加大反应总体积，延长反应时间。②DNA甲基化程度③反应条件高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即Staractivity现象。EcoRI在正常条件下识别并切割5‘GAATTC3’序列，但

6、在甘油浓度超过5%，可切割5‘PuPuATPyPy3’④酶的纯度⑤酶切反应的温度和时间大多数的内切酶，最适反应温度为37度，但也有例外，如SmaI为25度。酶解时间可以通过加大酶量而缩短。8、限制性内切酶的命名二、DNA连接酶1.两种DNA连接酶（1）大肠杆菌连接酶需要NAD作物辅助因子只能连接粘性末端。（2）T4噬菌体DNA连接酶以ATP作为辅助因子；不但能连接粘性末端；还能连接齐平末端；RNA:DNA杂交分子中RNA上的缺口。2.T4噬菌体RNA连接酶以ATP作为辅助因子；催化单链DNA或RNA的5

7、‘-p与3’-OH共价链接（1）连接条件①　必须是两条双链DNA。②　DNA3’端有游离的-OH，5’端有一个磷酸基团（P）。③　需要能量动物或噬菌体中：ATP；大肠杆菌中：NAD+22①　只能连接相邻核苷酸之间的缺口3.影响连接反应的因素(1)DNA末端的浓度(2)反应温度（3）ATP浓度三、常用的DNA聚合酶的特点1.共同特点把dNTPs连续地加到引物的3’—OH端。2.主要区别持续合成能力和外切酶活性不同3.DNA聚合酶在基因工程中的用途（1）大肠杆菌DNA聚合酶I基本性质：5’→3’的DNA聚合

8、酶活性;5’→3’的核酸外切酶活性；3’→5’的核酸外切酶活性。基本用途缺口前移标记法：Nicktranslation（切口平移）；制备³²P标记的探针。（2）Klenowfragment①Klenowfragment的性质具有5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性。（失去了5’→3’外切酶活性）。②基本用途v3’端补平补平限制性内切酶切后形成的3’隐蔽端。vDNA3’末端标记在3’隐蔽端加上放射性标记的dNTP。v在cD