基因工程概论重点总结 2-酶系重点

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1、基因工程概论重点总结2-酶系重点探针：一小段单链DNA或RNA片段，用于检测与其互补的核酸序列，双链DNA加热变性成为单链，随后用放射性同位素(P-32常用)、荧光燃料或酶标记成为探针PCR：PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外95度时解旋，35度时引物与单链按碱基互补配对结合，再调温度至65度左右DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。由PCR技术制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在95度，35度，65度之间很好的控制用大肠杆菌作为受体细胞表达目的基因的原因：①结构简单，生理生物背景和遗传背景清楚。

2、尤对其基因表达的调控机制有清楚了解②易于大规模培养，成本低廉③经遗传改造，已发展成一种安全的实验系统。拥有不同菌株及载体系列用于核酸操作的酶：1、限制性核酸内切酶　2、DNA连接酶　3、DNA聚合酶　4、核酸酶　5、核酸修饰酶限制性核酸内切酶定义：能特异性识别双链DNA某段特殊序列，并切割DNA双链的酶，主要存在于原核细菌中。主要作用是保护自身DNA不受限制及破坏外源DNA使之迅速降解限制性核酸内切酶的命名：属名+种名+株名寄主微生物属名的大写首字母种名前两个字母(小写)II类限制性核酸内切酶特性：特异性识别特定回文序列，并在识别

3、序列里或附近切割DNA双链。一般会产生3’-OH粘性末端（Pst1）、或5’-P粘性末端（EcoR1）、或平头末端（Pvu11）1U限制性核酸内切酶活性：最适条件下反应1小时，完全水解1微克双链标准DNA所需的限制性核酸内切酶的量不同盐度，选择同时酶切或先后酶切，处理：1、盐度相同：同时酶切，注意识别位点；盐度不同：若要同时酶切，则选择贵重酶盐度，加大普通酶浓度2、不同时酶切：先低盐度后高盐度或者先用一种缓冲液，再换一个缓冲液。影响限制性核酸内切酶活性的因素：1、物理因素：温度pH等　2、DNA分子的纯度　3、DNA分子的甲基化程

4、度（有识别序列，限制酶不一定能酶切成功）　4、缓冲液的性质。（反应体系甘油浓度不能超过50%）*星号活性(Staractivity)：极端条件下，限制性核酸内切酶的特异性降低，可识别和剪切相似或类似序列的现象。DNA连接酶：可修复DNA双链的Nick的酶，DNA连接酶不能连接两条单链DNA分子，也不能连接环状单链DNA分子，被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。（只能修补Nick，不能修补Gap）T4-DNA连接酶：1、可修复DNA双链的Nick　2、可修复DNA-RNA杂交双链的Nick　3、可连接平头末端1UDNA连

5、接酶的酶活性：最佳反应条件反应1小时，完全连接1微克λ-DNA所需的DNA连接酶的量。为什么粘性末端连接比平头连接简单：因为在复性条件下，粘性末端间的连接属分子内反应，平头末端间的反应属分子间反应所以反应速度慢得多。粘性末端（低温连接，有利于氢键形成）平头末端（37℃高温连接增加末端碰撞几率）5’-3’DNA聚合酶活性：单链DNA模板，带3’-OH的DNA引物3’-5’核酸外切酶活性：切割5’-P端的双链上的核苷酸5’-3’核酸外切酶活性：校正作用DNA聚合酶：以一DNA单链为模板合成另一条链时，将dNTP连接到链上的酶的分子。大

6、肠杆菌DNA聚合酶I（DNApol1）缺口前移标记法（Nicktranslation）制备32P标记的探针：当双链DNA出现缺口时，DNA聚合酶的5’-3’DNA聚合酶活性会在3’-OH端开始添加脱氧核糖核苷酸（用α-32P-dATP标记即可），而与此同时3’-5’DNA外切酶活性会从5’-P端将切除原有的核苷酸，从而切口前移。Klenow酶：大肠杆菌DNA聚合酶I经过枯草杆菌蛋白酶处理后的C端2/3的大肽段，有5’-3’DNA聚合酶活性3’-5’核酸外切酶活性。用途：1、补平由核酸内切酶产生的5’粘性末端　2、在cDNA克隆中，

7、用于合成第二链　3、应用sanger双脱氧链末端终止法进行DNA测序T4-DNA聚合酶：1、5’-3’的DNA聚合酶活性和3’-5’的核酸外切酶活性2、无dNTP时，可以从任何3’-OH端外切→切除3’-OH粘性末端3、只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止。4、四种dNTP都在时DNA聚合酶活性占主导地位。反转录酶5’-3’聚合活性用mRNA的poly（A）做模板，合成cDNA。核酸酶：单链核酸内切酶：S1核酸酶来自稻谷曲霉素Zn2+为必须[注意限制性核酸内切酶为Mg2+]内切单链DNA或RNA带有Nick的，切除；带有

8、gap的，切除。单链内切双链外切核酸酶：Bal31核酸酶来自艾氏交替胞菌Ca2+依赖有Nick，Gap切除，完整双链则外切。用途：诱发DNA连续缺失突变，可探测基因左右边界，基因定位；缩短DNA分子长度核酸修饰酶：末端脱氧核苷酰转移酶：TdTMg2