间接免疫荧光法实验操作常见问题

《间接免疫荧光法实验操作常见问题》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、间接免疫荧光法实验操作常见问题广东FAE张嘉华主要内容1.实验操作流程2.应避免的错误3.分析问题的来源4.不符操作对结果的影响一、实验操作流程间接免疫荧光法操作流程（1）准备样本稀释30ulperfield(5*5mm)加样血清温育1secflush清洗5mincuvette间接免疫荧光法操作流程（2）加荧光标记抗体25ulperfield(5*5mm)温育清洗1secflush5mincuvette封片10ulperfield(5*5mm)结果判断二、应避免的错误间接免疫荧光法错误的避免(1)实验准备阶段：•用通常的家用洗涤剂和蒸馏水清洗加样

2、板的反应区，用纸巾吸干。•只有当生物薄片载片平衡到室温后方可打开包装。•只能在手可触摸的区域作标记。•不要触摸生物薄片。间接免疫荧光法工作台的布置间接免疫荧光法错误的避免(2)样本稀释阶段：•在稀释前用旋涡混匀器混匀标本。•用可靠的去离子水配置PBS-吐温缓冲液。•用PBS-吐温缓冲液稀释病人标本。•因塑料制品会吸附抗体，造成抗体浓度的下降，所以最好用玻璃管稀释样本。间接免疫荧光法错误的避免(3)滴加样本至加样板的反应区：•加样量要准确。•避免产生气泡。•加完所有样本后方可开始温育。间接免疫荧光法错误的避免(4)血清温育阶段：•确保液滴与生物薄片接触良好。•避免快速

3、移动加样板。•避免缩短或延长温育时间。•常温进行温育。间接免疫荧光法错误的避免(5)清洗：•用PBS-吐温缓冲液流水迅速冲洗载片(用大口杯，不要用细颈瓶)。载破片垂直拿置，流水沿载破片上沿冲洗，避免水流直接冲洗基质面。•流水冲洗载片后立即放进盛有PBS-吐温缓冲液的洗杯中浸洗。载片一定要浸洗。清洗间接免疫荧光法错误的避免(6)载片在第一次清洗后的处理：•不要擦拭反应区之间的间隙。•5秒钟内进行第二次温育。载片的擦拭间接免疫荧光法错误的避免(7)荧光素标记的二抗（结合物）的使用：•荧光二抗直接使用。•不要将结合物放在阳光直射处。•加样量要准确。•从现在起，避免载片被阳

4、光直射。间接免疫荧光法错误的避免(8)封片：•盖玻片上每反应区滴加PBS-甘油8ul，不要超过10ul。•立即检查盖玻片与载片是否吻合良好，必要时可调整盖玻片的位置。有气泡存在时，需重新进行封片。封片间接免疫荧光法错误的避免(9)结果判断：•将荧光显微镜放置在光线比较暗的房间。•使用合适的物镜和滤光片。判断组织用的物镜有：20倍镜判断细胞用的物镜有:40倍镜三、分析问题的来源间接免疫荧光法问题的来源当出现问题时，我们应该检查是否有：•图像不清•气泡•荧光强度减弱•组织有非特异反应•组织根本不反应间接免疫荧光法问题的来源(1)镜下图像不清主要的原因：•封片基质过量。•

5、盖玻片与载片吻合不好。•物镜的镜头模糊不清。•使用了两张盖玻片。•盖玻片表面模糊不清。•盖玻片表面有水滴。•显微镜有问题。间接免疫荧光法问题的来源(2)气泡：•封片不正确。•除去封片基质中的气体。间接免疫荧光法问题的来源(3)荧光强度减弱：主要的原因：•显微镜调整的不合适。•本来应直接使用的血清又作了进一步的稀释。•荧光素标记的二抗暴露在阳光直射处。•温育后的载片暴露在阳光直射处。间接免疫荧光法问题的来源(4)组织有非特异性反应显微镜镜检过程中生物薄片被淬灭温育过程中有气泡灰尘颗粒组织折叠间接免疫荧光法问题的来源(5)组织切片没有任何反应主要的原因：•没有进行血清或

6、二抗的温育。•缓冲液质量不好。没有进行血清温育没有进行二抗温育间接免疫荧光法问题的来源(5)部分组织没有任何反应主要的原因：•基质被擦拭、挤压、掀盖导致基质破坏。由刮或擦拭所引起的基质损坏由于挤压所引起的基质损坏由于掀盖玻片所引起的基质损坏四、不符的操作对结果的影响载片过度干燥（1)(血清温育后5分钟Hep-2细胞)对照过度干燥细胞正常形态改变载片过度干燥(血清温育后5分钟猴肝)对照过度干燥细胞正常形态改变TrocknungnachKonjugatschritt载片过度干燥(BIOCHIPMitte(20er)酶结合物温育后5分钟)对照过度干燥细胞正常形态改变载片保

7、存不当(2)(温度或湿度过高)对照温度或湿度过高荧光素着色不均使用自来水配置PBS-吐温缓冲液(3)正常操作Hep-2细胞猴肝使用自来水配置PBS-吐温缓冲液：细胞不清晰，背景不干净Hep-2细胞猴肝使用蒸馏水清洗浸泡载片(4)正常操作Hep-2细胞猴肝使用蒸馏水清洗浸泡载片：细胞肿胀变形，滴度下降Hep-2细胞猴肝PBS-吐温缓冲液常温（25℃）放置1周(5)正常操作Hep-2细胞猴肝PBS吐温缓冲液常温放置1周：背景不干净,失去清洗的作用Hep-2细胞猴肝缓冲液配置只使用PBS(6)缓冲液配置只使用PBS：正常操作背景不干净，1：100滴度结果变阴性清洗时只