间接免疫荧光法测ana教学教材.ppt

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1、间接免疫荧光法测ANAANA检测的意义有助于疾病的诊断如抗Sm是SLE标记抗体；抗ScL-70是SD的标记抗体；抗Jo-1是PM/DM的标记抗体；观察疾病活动度和治疗反应研究发病机理【ANA分类】抗DNA（dsDNA,ssDNA)抗组蛋白（Histone)抗非组蛋白（Nonhistone,ExtractableNuclearAntigen,ENA）抗核仁（Nucleolus）几种ENA的由来及同义词Sm：病人名：SmithRNP:u1RNP或nRNPNuclearRibonucleoprotei

2、nSSA:ROSjogren’ssyndromeASSB:La,Ha,Sjogren’ssyndromeBJo-1:病人JohnScL-70:Scleroderma【ANA由来】中性粒细胞DNP(DNA-Histone)+抗DNP+补体均质体LE细胞LE细胞：并非SLE特有，PM、SD、RA、SS等结缔组织病，药物过敏，慢活肝等亦可阳性。抗DNP取代LE细胞的检测+ANA的筛选：间接免疫荧光法++抗原抗体（血清）抗原—抗体第二抗体ANA的筛选：间接免疫荧光法实验原理：生物薄膜载片上的IgA、Ig

3、G、IgM类特异性抗体可以与抗核抗原反应；随后，结合抗体可与标记荧光的二抗进行反应，并可在荧光显微镜下观察。抗原人特异性抗体FITC标记的抗人抗体FITCFITC载片实验原理：生物薄片马赛克TM技术【实验步骤】实验步骤一：准备检查加样板是否反应区亲水而周边疏水？如果不是，可用湿纸巾擦拭，必要时可使用家用洗涤剂，再用水彻底冲洗。需要消毒时，可于3％的SekuseptExtra（汉高公司）中浸泡1小时。只有当载片平衡到室温后方可打开袋子。不要触及生物薄片。按照要求用记号笔对玻片进行标记。实验步骤二：

4、样品准备1:100稀释血清标本。每次实验均需加入阳性和阴性对照。对照血清使用前必须混匀。实验步骤三：加样在加样板的每个反应区加入稀释血清，避免产生气泡。滴加完所有待测标本后才开始温育。使用聚苯乙烯加样板。加样体积:25µl/反应区(5x5mm)12345样品1样品2样品3阳性对照阴性对照实验步骤四：孵育将载片盖在加样板对应的凹槽里，反应即开始。确保每个标本均能够与生物薄片相接触，而标本之间不相互接触。室温（18-25℃）温育30分钟。实验步骤五：冲洗用烧杯盛PBS-Tween缓冲液，流水冲洗载片

5、，然后立即放入装有PBS-Tween缓冲液的小杯中浸洗至少5分钟。实验步骤六：加样将20μl荧光标记的抗人球蛋白（荧光二抗）加入洁净加样板的每个反应区。完全加完所有的二抗后，方可继续温育（最多可加50个载片）。建议使用连续加样器。加样前应使用加样器混匀。为节约时间，可在第一步温育的同时滴加酶结合物至另一个加样板的反应区中。实验步骤七：孵育从PBS-Tween清洗缓冲液中取出一张载片，5秒钟内用吸水纸擦一下背面和边缘后，立即将载片覆有生物薄片的一面朝下，盖在加样板的凹槽里。注意：为防止破坏基质，不

6、要擦拭反应区的间隙。检查生物薄片是否与液滴接触良好，然后继续下一张。从现在开始，注意避免阳光直射载片。室温温育30分钟。实验步骤八：冲洗用烧杯盛PBS-Tween缓冲液，流水冲洗载片，然后立即放入装有PBS-Tween缓冲液的小杯中浸洗至少5分钟。可在每150ml磷酸盐缓冲液中加10滴(150µl)伊文氏蓝进行复染。实验步骤九：封片在盖玻片上滴加甘油/PBS。封片体积:10µl/反应区(5x5mm)从PBS-Tween清洗缓冲液中取出一张载片，用纸擦干背面和四边，注意不要擦拭反应区间隙。将载片的

7、生物薄片朝下置于准备好的盖玻片上，立即检查盖玻片是否放入载片的凹槽里，如有必要，需调整位置，正确放置。然后再进行下一个载片的操作。实验步骤十：结果判断荧光显微镜下观察荧光。结果判读：荧光显微镜下观察细胞核发黄绿色荧光为阳性染色细胞，不发荧光为阴性。抗原片中出现阳性染色细胞为ANA阳性，否则为阴性。阳性待检血清可作进一步稀释后测定效价。【均质型】细胞核呈均匀一致的荧光【核仁型】核仁部分呈现荧光【斑点型】(颗粒型)细胞核内呈现斑点状荧光【胞浆型】【着丝点型】混合型：存在两种以上的类型混合型：存

8、在两种以上的类型ANA结果判断1：100阴性阴性，标本中未检测到抗核抗体1：100阳性微量对于核均质性、着丝点、核点型等荧光模式，提示某种风湿性疾病或其他疾病1：320阳性阳性提示某种风湿病或其他疾病滴度定义：与相同稀释倍数的阴性血清相比，能观察到特异性荧光反应的最高稀释度【临床意义】总的ANA检测在临床诊断与鉴别诊断中是一个极为重要的筛选试验。绝大多数自身免疫性疾病均可呈阳性。ANA阳性者进一步检测各亚类ANA抗体对明确诊断、临床分型、病情观察、预后及治疗评价有重要意义。未经治疗的、活动性SL