不同血液保存方法对RNA提取的影响(简易版)

《不同血液保存方法对RNA提取的影响(简易版)》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、不同血液保存方法对RNA提取的影响一、引言1.1探索血液RNA保存方法的必要性全血作为较易获取的人体标本，特别适用于实验室和临床检测。高质量的RNA可以满足RT-PCR、qRT-PCR、Northernblot、基因表达谱、转录组测序、[1]核酸酶保护实验和阵列分析等生物学下游实验的研究需求。但由于RNA自身结构为单链状态，极不稳定，同时广泛分布的RNase时刻发挥着降解RNA的功能，其活性难以被抑制，因此使得从全血中提取RNA以及对RNA的保存相对困难。1.2常见的血液RNA保存方法[2]第一种为分离白膜层，加入RNAlater保护剂冻存-80℃。此种方法为目前样本库常用的血液R

2、NA保存方法，采血后需在常温保存4小时内完成白膜层分离，或在采血2小时内放入4℃冰箱保存，24小时内4℃低温分离，将分离获得的白膜层用RNAlater保护剂保存，RNAlater的主要作用为提供高盐环境使细胞脱水，抑制核酸酶活性。此种方法的优势在于可将全血中大部分对于提取RNA无用的成分去除，缩减了样本的体积，更加便于保存。但此种方法的弊端在于，首先分离白膜层的过程较为繁琐，需要多次离心，在临床医院或临时的采血点往往难以实施，其次高盐脱水后的细胞复性困难，提取RNA的难度增加，且高盐组分不易去除，提取的RNA纯度不高，最后血液在分离白膜层过程中，会有部分白细胞及RNA组分缺失。第二

3、种为专用的静脉真空采血管，其中添加了特殊的试剂，可以保护细胞内的RNA，防止降解，但此方法核酸得率偏低，需大量血液来支撑下游实验研究。本实验内容纵向地比较了两种血液保存方式下，RNA保存效果的对比；并探索了在不同保存温度及不同保存时间下，RNA的保存效果。希望本文可为广大的科研同胞们提供帮助。二、材料和方法2.1标本来源本组血液样品均采自同一志愿者，采用标准静脉穿刺技术，一次性使用真空采血管EDTA·Na25ml（购于江苏康捷医疗器械有限公司）采集静脉血，全部标33本白细胞计数范围为3.16×10~3.25×10。2.2方法2.2.1白膜层分离采集3管新鲜血液，每管5ml，采血后1

4、0min内3,000rpm离心10min，吸弃血浆，加入和血浆等体积的PBS缓冲液，颠倒混匀。取15ml离心管，加入7.5mlFicoll-paqueTMPLUSlymphocyteisolationsterilesolution（购于GE公司，Lot.10244745），吸取采血管中血细胞加入分离液中分层，2,000rpm离心20min。吸弃上层PBS，移液器吸取白膜层转移至5ml离心管中，加入PBS吹打混匀，2,000rpm离心10min，弃上清。加入400lPBS缓冲液重悬，然后分别缓慢加入不同RNA保护液。Q组：加入1.2mlRNAlaterRNAStabilizatio

5、nReagent（购于Qi***n公司，Lot.15****995）；A组：加入1.2mlA***onRNAlaterSolution（购于英**基，Lot.00****70）；B组：加入1.2mlRNAfixer保存液（购于Bioteke公司，Cat.RP1302）。将三管样品均冻存于-80℃保存。2.2.2白膜层RNA提取（沉淀法）取200l保存的白膜层，加2mlRL裂解液，涡旋混匀30s，室温裂解15min；加入300l氯仿，涡旋混匀10s，室温放置3min；12,000rpm离心10min，吸取水相，加入等体积异丙醇，-20℃沉淀至少2h，若出现浑浊，加入DEPC水配制

6、的50%异丙醇，直至混浊消失；4℃，12,000rpm离心15min，小心弃上清；加入1ml75%乙醇漂洗2次；30lRNase-freeH2O溶解。2.2.3白膜层RNA提取（离心柱法）严格按照试剂盒操作说明操作，所用试剂盒为：血液（液体样本）总RNA快速提取试剂盒（离心柱型）（购于BioTeke，Cat.RP4001）；动物组织总RNA提取试剂盒（离心柱型）（购于Tiangen，Lot.P4920）。2.2.4血液RNA保存管提取RNA采集新鲜全血，30min内转移2.5ml至10ml血液RNA保存管（购于BioTeke，Cat.ST1001）中，涡旋混匀30s，室温放置10

7、min，而后转移至不同条件保存。提取时取1.6ml液体，恢复室温，放置10分钟，加入200l氯仿，涡旋混匀10s，室温放置3min；4℃12,000rpm离心10min，吸取水相，加入等体积70%乙醇，混匀，将混合液加入RA柱，12,000rpm离心1min，弃滤液；加入500l去蛋白液RE，4℃12,000rpm离心1min，弃滤液；加入700l漂洗液RW，4℃12,000rpm离心1min，弃滤液；加入500l漂洗液RW，4℃12,000rpm离心1mi