01.双歧杆菌培养基的优化---实验方案

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1、万方数据第35卷第3期2005年9月工业微生物InduS廿ialMi∞0bi01pgyVd．35No．3S印t．2005双歧杆菌培养基的优化杜鹏，李艾黎，霍贵成。(东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨，150030)摘要针对双歧杆菌的营养需要，分别采用单因素试验和正交试验，优化培养基成分及用量。得出最优培养基(C盯)配比：大豆蛋白胨1．67％，酪蛋白胨0．83％，乳糖O．5％，酵母浸出粉0．5％，低聚糖0．7％，胡萝卜汁15％。最后测定双歧杆菌在最优培养基中的生长曲线，并同时测定pH和吸光值的变化，确定培养终

2、止时间为12h，茵数可达2．18×109CFU／mL，且发酵培养基具有极显著的增菌效果(p<0．01)。关键词：双歧杆菌；培养基；优化双歧杆菌是人体消化道内具有益生作用的优势菌群，迄今为止已发现的双歧杆菌有32个种，其中分离自人体的有12个种。目前可用于保健食品有5种：两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌和青春双歧杆菌⋯。已见报道的双歧杆菌的生理功能包括：调整肠道菌群[2’3】，增强免疫系统[4J，防止便秘，降低结肠癌的发病率[5】，产生抗菌素[6]，提高蛋白质和维生素的代谢，缓解乳糖不耐症，治疗肝损伤

3、，抗肿瘤，降低胆固醇等[7】。因此于双歧杆菌相关的研究和产品开发引起了人们的极大关注。目前双歧杆菌类产品主要有食品、保健品、药品等，而在此类产品的开发中，如何缩短培养时间并提高活菌数目，就成为了技术关键。本研究就是基于此目的，优化婴儿双歧杆菌培养基及增殖因子，以缩短培养时间并提高活菌数。双歧杆菌营养要求较高，培养基中必须含有丰富的氨基酸，维生素，糖类物质及缓冲盐类，并且除了基本的营养需要之外，还需添加促进双歧杆菌生长的双歧增殖因子，其中增殖因子包括：含N一乙酰葡萄糖胺的糖类，蛋白质经酶或酸水解形成的肽类，泛酰巯基乙胺

4、，糖蛋白和糖肽，植物提取物中的增殖因子和胞壁脂酶等。研究双歧杆菌的增殖必须考虑其营养要求的复杂性，并在了解其生长代谢规律的基础上优化培养基的组成。Mahalakshmi等研究了两歧双歧杆菌在添加了N一乙酰葡萄糖胺和酵母粉的乳清培养基中的生长特性[8]。Chou等人研究了长双歧杆菌和婴儿双歧杆菌在添加酵母粉、蛋白胨、胰蛋白胨与胰酶水解酪蛋白的豆乳中的生长特性[9】。孟祥晨等采用正交实验优化了青春双歧杆菌基础培养基及增殖因子的用量，得到了婴儿双歧杆菌增菌培养基[10

5、。崔萱林等采用保蒲培养基提高了婴儿双歧杆菌的产量u1

6、

7、。因此我们根据婴儿双歧杆菌的营养需要和生长特性，优化培养基组成以缩短培养时间并提高活菌量，为今后婴儿双歧杆菌的扩大发酵打下基础。1材料与方法1．1主要材料婴儿双歧杆菌(B．吮亿九￡娥简称BI)由东北农业大学畜产品加工研究所保藏。TPY培养基[12l，1L培养基中含有酪蛋白胨109，大豆蛋白胨59，酵母粉2．59，葡萄糖159，吐温801mL，K2HPq29，MgCl2‘6H200．59，CaCl20．15g，ZnS04·7H200．259，FeCl30．19，半胱氨酸盐酸0．59，调pH至6．5，0．1MPa灭菌15

8、min。酪蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母粉均为英国Oxoid公司生产；低聚果糖购自香港福斯公司；葡萄糖、乳糖、半乳糖为国产。西红柿汁，胡萝卜汁和肝浸液等为实验室自行制备[13

9、。1．2仪器与设备基金项目：国家“863计划”课题(2002AA248041)资助作者简介：杜鹏(1978～)，男，助教，博士研究生。*通讯作者，E—nlail：gchuo@、，ip．0451．net一14—万方数据第3期杜鹏，等：双歧杆菌培养基的优化第35卷厌氧培养箱、全自动蒸汽灭菌罐(上海三申)、光学显微镜(0I．㈣『S)、pH计(梅特勒一托利多

10、Delta320)、紫外可见分光光度计(日本岛津uV_2401)等。1．3试验方法1．3．1菌种活化、传代与接种选用n)Y培养基活化冻干的菌种，37℃厌氧培养48h，按5％接菌量进行接种。1．3．2培养基成分的优化分别采用单因素试验优化氮源(A)、碳源(B)和增殖因子(C)的种类。因素水平表见表l。其中A因素为2种氮源的质量比例，B因素为碳源的种类，C因素为增殖因子的种类。优化酵母浸出粉(D)和低聚糖(E)的添加量。其因素水平表见表1。其中D因素为酵母浸出粉的添加量，E因素为低聚糖的添加量。表1培养基成分优化因素水平

11、表*酪蛋白胨与大豆蛋白胨的质量比。1．3．3培养基各成分用量的优化采用正交试验设计b(34)优化1．3．2选出的培养基氮源(A)、碳源(B)和增殖因子(C)的用量。因素水平表见表2。其中A因素为氮源添加量，B因素为碳源添加量，C因素为增殖因子添加量。表2培养基各成分用量优化正交试验因素水平表(b(34)1．3．4菌液pH值的测定用梅特勒一托利多