(中文) DIG High Prime DNA标记及杂交检测试剂盒 I

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1、DIGHighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKitIDIGHighPrimeDNA标记及杂交检测试剂盒I说明书版本：Version11（2010年8月）利用随机引物法及DIG-dUTP（碱不稳定）进行DNA标记反应，采用酶联免疫方法及发色底物NBT/BCIP进行杂交分子的显色。2本试剂盒可对10ng-3μgDNA进行12次标记反应，可进行24次杂交检测反应（100cm杂交膜）。产品目录号：11745832910试剂盒于-15~-25℃保存11.概况1.1说明书内容1.概况………………………………………………………………………………………21.1说明书内

2、容…………………………………………………………………………………21.2试剂盒组成…………………………………………………………………………………32.介绍………………………………………………………………………………………42.1产品概述…………………………………………………………………………………43.实验步骤和需要的材料…………………………………………………………………73.1实验开始前准备…………………………………………………………………………73.2DIG-DNA标记……………………………………………………………………………73.3定量标记反应效率…………………………………………………

3、……………………103.4DNA转膜和固定…………………………………………………………………………123.5杂交………………………………………………………………………………………133.6免疫检测…………………………………………………………………………………143.7探针洗脱和重探…………………………………………………………………………164.结果………………………………………………………………………………………174.1典型结果…………………………………………………………………………………175附录………………………………………………………………………………………185.1疑难问题解决……

4、………………………………………………………………………185.2参考文献…………………………………………………………………………………1821.2试剂盒组成管/瓶号标签成分及功能1DIG-HighPrime•50μl，用于DNA的随机引物法高效标记，即用•5×标记反应液，含浓度优化的随机引物、核苷酸、DIG-dUTP（碱不稳定）、Klenow酶及缓冲液。•澄清的粘性溶液2DIG-labeledControlDNA•20μl，用于确定反应标记效率•pBR328DNA(5μg/ml,BamHI线性化处理)•澄清溶液3DNADilutionBuffer•3×1ml•10mMTris-HCl,1mM

5、EDTA（含50μg/ml鱼精，pH8.0,25℃)•澄清溶液4Anti-Digoxigenin-AP•100μlConjugate•750U/ml，Fab片段，羊源，结合了碱性磷酸酶•澄清溶液5NBT/BCIP•6×1ml,碱性磷酸酶显色底物•50×储液[18.75mg/mlNBT，9.4mg/mlBCIP，67%（v/v）DMSO]•澄清溶液，颜色呈黄色或棕色6Blockingsolution•4×100ml•10×储液•黄色，粘性溶液7DIGEasyHybGranules•可制备成4×100ml溶液，见P13•杂交液杂交反应所需的仪器和其他反应试剂请根据您的实验操作流程准备杂交反应所需

6、的仪器和其他试剂，参见下表：（本说明书）杂交操作设备试剂步骤3.2DIG-DNA标记水浴设备•水，PCR级别•0.2MEDTA（pH8.0)，灭菌3.3定量标记反应效率带正电荷的尼龙膜*•DIGWashandBlockBufferSet*•TE缓冲液或•洗涤缓冲液•马来酸缓冲液•检测缓冲液•TE缓冲液33.4DNA转膜和固定紫外交联设备•2×SSC或•10×SSC3.5杂交•带正电荷的尼龙膜*•杂交袋*或•耐热的封闭塑料袋或杂交滚筒瓶注意：使用DIGEasyHyb作为杂交缓冲液时，不可用开口托盘3.6免疫检测•与杂交膜大小相适的容器•DIGWashandBlockBuffer•杂交袋*Set

7、*•TE缓冲液或•洗涤缓冲液•马来酸缓冲液•检测缓冲液•TE缓冲液3.7探针洗脱和重探•大托盘•10×SSC•水浴设备•10%SDS•0.2MNaOH带*的试剂为罗氏应用科学部提供的试剂。2.介绍2.1产品概述反应原理DIGHighPrimeDNA标记检测试剂盒（I）采用地高辛（DIG，一种甾类半抗原）进行DNA标记，所获得的探针用于后续的杂交反应，带有地高辛分子的杂交子通过酶联免疫反应进行显色检测。步骤描述