DIG_High_Prime_DNA_Labeling_and_Detection_Starter_Kit_I中文翻译

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1、只用于生命科学研究，不能用于诊断程序仅用于体外实验DIGHighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKitI采用地高辛-dUTP进行随机引物DNA标记，碱性标记，利用CSPD化学发光检测，随时即用。货号：11745832910此试剂盒储存条件：-15℃到-25℃。此试剂盒可对10ng-3μgDNA进行12次标记反应，可检测10×10cm2面积的杂交膜24张。指导手册2005.12版1前言201.1内容表1前言1.1内容表1.2试剂盒成分2.介绍2.1产品简介3.操作

2、步骤和所需材料3.1在你开始前3.2流程图3.3地高辛标记DNA3.4标记效率的确定3.5DNA的转移和固定3.6杂交3.7免疫检测3.8DNA印记的洗脱和再杂交4.附录4.1故障排除4.2参考文献4.3订购信息1.2试剂盒的成分20瓶号标记内容包括功能1DIG-高效引物50μL地高辛标记的高效引物5×浓度的标记混合物：优化的浓度的随机引物，核苷酸，地高辛标记的dUTP（碱标记的），Klenow酶和缓冲液成分随时可用澄清的粘液用于DNA的高效随机引物标记2DIG标记的对照DNA20μL5μg/mL质

3、粒pBR328DNA（用BamHI线性化）澄清溶液用于确定标记效率3DNA稀释缓冲液3管1mL50μg/mL鱼精DNA,10mMTris-HCl,1mMEDTA,pH8.0在25℃澄清溶液4抗地高辛的碱性磷酸酶结合物50μL750U/mL从羊中获取的，Fab段，结合碱性磷酸酶澄清溶液5氮蓝四唑/5溴4氯3吲唑基磷酸盐6管1ml；50X浓度的存储液（18.75mg/mlNBT和9.4mg/mlBCIP溶于67％（W/V）的DMSO中；可显现淡黄色与棕色；与碱性磷酸盐反应澄清溶液6封闭液4×100mL1

4、0×浓度黄色，粘液7地高辛杂交颗粒100mL地高辛杂交液共4瓶，用于DNA杂交（第17页配制）20附加仪器与所需试剂除了上表中列出的试剂外，你必须准备一些溶液。在下表中，你可以找到不同操作程序需要准备的设备概要。在每个操作程序的前面提供了详细的信息。操作程序仪器设备试剂3.2DIG-DNA标记水浴灭菌的双蒸水0.2MpH8.0灭菌的EDTA3.3标记效率的半定量带正电荷的尼龙膜*地高辛洗涤和封阻缓冲组合*或者TE缓冲液洗涤缓冲液马来酸缓冲液检测缓冲液，TE缓冲液3.4DNA转移和固定紫外光盒或者商业

5、化可用于紫外交联的其他设备2×SSC或者10×SSC3.5杂交尼龙膜，带正电荷*杂交袋*，或者耐热的塑料袋或者滚筒瓶注意：当用地高辛杂交缓冲液工作时，不要用开口的托盘。3.6免疫检测耐热的塑料袋或者滚筒瓶杂交袋*合适体积的容器用于杂交地高辛洗涤和封阻缓冲液组合*，或者TE缓冲液洗涤缓冲液马来酸缓冲液检测缓冲液，TE缓冲液3.7DNA斑点的脱色和重新标记探针大的托盘水浴10×SSC10%SDS0.2MNaOH*标记的产品可以从RocheAppliedScience获得。2.介绍202.1产品概况实验原

6、则此试剂盒采用DIG(地高辛)，一种甾类半抗原，steroidhapten去标记DNA探针用于杂交和后续的免疫检测[1,2,3]。步骤描述DNA标记根据随机引物标记技术采用地高辛标记引物获得了地高辛标记的DNA探针。地高辛标记的高效引物是一种专门生产的反应混合物，其中含有地高辛dUTP,碱性标记（图1）和所有的试剂，包括随机引物标记所必须的酶，已预先混合优化的5×浓度反应缓冲液。杂交根据标准方法，地高辛标记的探针可以与固定在膜上的核酸杂交。采用碱标记形式的地高辛-11-dUTP能够更加容易和有效的被

7、洗脱下来，使固定在膜上的核酸可以与其他的地高辛标记探针再次杂交。免疫检测杂交探针可以用抗地高辛的碱性磷酸酶进行免疫检测，Fab段，然后与显色底物NBT/BCIP发生显色反应图1DIG-dUTP，碱性标记应用地高辛标记DNA探针可以用于：所有类型的滤膜杂交总基因组DNA中单拷贝基因的检测，甚至对于高度复杂的生物体也可以进行检测，如人，大麦和小麦。样品材料至少100bp的DNA片段线性的质粒，cos质粒或者DNA超螺旋的DNA实验时间此表格列出了每一步实验所需的反应时间。20步骤反应时间DNA标记1小时

8、-过夜杂交6小时或者过夜免疫检测1.5小时底物显色检测0.5――16小时检测数量一个试剂盒足够用于:12个标准的标记反应，每个反应的膜板DNA不超过3μg；并可以检测24张10×10cm2的杂交膜。质量控制根据操作步骤中的说明对未标记的对照DNApBR328进行标记，并按照下面的标准检测操作方法在点杂交中用0.1pg同源DNA经过16小时显色即可检测到（或1pg的同源DNA经过1小时的显色即可看到颜色）。试剂盒的储存和稳定性未开封的试剂盒在保质期内可以稳定的存放在-1