地高辛标记与检测DNA试剂盒说明书.doc

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1、地高辛标记与检测DNA试剂盒DIGDNALabelingandDetectionKit采用地高辛-dUTP进行随机引物DNA标记，碱性标记，利用NBT/BCIP酶联免疫，随时即用。此试剂盒可对10ng-3μgDNA进行25次标记反应，可检测10×10cm2面积的杂交膜50张指导手册1前言1.1内容表1前言1.1内容表1.2试剂盒成分2.介绍2.1产品简介3.操作步骤和所需材料3.1在你开始前3.2流程图3.3地高辛标记DNA3.4标记效率的确定3.5DNA的转移和固定3.6杂交3.7免疫检测可编辑word文档3.8DNA印记的洗脱和再杂交1.2试剂

2、盒的成分瓶号标记内容包括功能1无标记对照DNA12无标记对照DNA23DNA稀释缓冲液2管1mL50μg/mL鱼精DNA,10mMTris-HCl,1mMEDTA,pH8.0在25℃澄清溶液4DIG标记的对照DNA20μL5μg/mL质粒pBR328DNA（用BamHI线性化）澄清溶液用于确定标记效率5六聚核苷酸混合物6标记用混合物7DNA聚合酶1大片段标记级8抗地高辛的碱性磷酸酶结合物200μL750U/mL从羊中获取的，Fab段，结合碱性磷酸酶澄清溶液9NBT/BCIP10封阻试剂附加仪器与所需试剂可编辑word文档除了上表中列出的试剂外，你必

3、须准备一些溶液。在下表中，你可以找到不同操作程序需要准备的设备概要。在每个操作程序的前面提供了详细的信息。操作程序仪器设备试剂3.3DIG-DNA标记水浴灭菌的双蒸水0.2MpH8.0灭菌的EDTA3.4标记效率的半定量带正电荷的尼龙膜*地高辛洗涤和封阻缓冲组合*TE缓冲液或者洗涤缓冲液马来酸缓冲液检测缓冲液3.5DNA转移和固定紫外光盒或者商业化可用于紫外交联的其他设备2×SSC或者10×SSC3.6杂交尼龙膜，带正电荷*杂交袋*，或者耐热的塑料袋或者滚筒瓶（分子杂交炉）注意：当用地高辛杂交缓冲液工作时，不要用开口的托盘。DIGEasyHyb（杂

4、交缓冲液，需单独购买）3.7免疫检测耐热的塑料袋或者滚筒瓶杂交袋*地高辛洗涤和封阻缓冲组合*TE缓冲液或者洗涤缓冲液马来酸缓冲液检测缓冲液3.8DNA斑点的脱色和重新标记探针大的托盘水浴DMF0.2MNaOH，0.1%SDS可编辑word文档2×SSC*标记的产品可以从RocheAppliedScience获得。2.介绍2.1产品概况实验原则此试剂盒采用DIG(地高辛)，一种甾类半抗原，steroidhapten去标记DNA探针用于杂交和后续的免疫检测。步骤描述DNA标记根据随机引物标记技术采用地高辛标记引物获得了地高辛标记的DNA探针。地高辛标记

5、的高效引物是一种专门生产的反应混合物，其中含有地高辛dUTP,碱性标记和所有的试剂，包括随机引物标记所必须的酶，已预先混合优化的5×浓度反应缓冲液。杂交根据标准方法，地高辛标记的探针可以与固定在膜上的核酸杂交。采用碱标记形式的地高辛-11-dUTP能够更加容易和有效的被洗脱下来，使固定在膜上的核酸可以与其他的地高辛标记探针再次杂交。免疫检测杂交探针可以用抗地高辛的碱性磷酸酶进行免疫检测，Fab段，然后采用即时可用的化学发光底物NBT/BCIP可以看到杂交结果。应用地高辛标记DNA探针可以用于：所有类型的滤膜杂交样品材料至少100bp的DNA片段线性

6、的质粒，cos质粒或者DNA超螺旋的DNA实验时间可编辑word文档步骤反应时间DNA标记1h-O/N杂交6horO/N免疫检测1.5h显色0.5-16h检测数量一个试剂盒足够用于:25个标准的标记反应，每个反应的膜板DNA不超过3μg；并可以检测50张10×10cm2的杂交膜。质量控制根据操作步骤中的说明对未标记的对照DNA【pBR328】进行标记，并按照下面的标准检测操作方法在点杂交中用0.1pg同源DNA点在膜上16h后成色显影检测。试剂盒的储存和稳定性未开封的试剂盒在保质期内可以稳定的存放在-15℃到-25℃（保质期印在标签上）。在干冰中运

7、输。一旦开封，请根据下表选择适宜的储存条件。试剂盒成分储存条件抗地高辛碱性磷酸酶结合物（8号管）2-8℃稳定。NBT/BCIP(9号管)2-8℃，避光保存或者15-25℃保存4周封阻液（10号管）未开封时，2-8℃或者15-25℃稳定；一旦开封，应分装并储存在-15℃到-25℃或者无菌条件下2-8℃间可以稳定保存1个月；工作溶液都应是新鲜配制的灵敏度和特异性采用southern杂交从1μg人胎盘DNA（经BglⅡ或EcoRⅠ酶切）中检测到单拷贝基因。可编辑word文档3．实验步骤和所需材料3.1在你开始前主要的操作要求此表中描述了地高辛标记和检测中

8、主要的提示：要求指引在清洁的条件下进行操作高压灭菌地高辛系统的试剂过滤灭菌的溶液包括：SDS,吐温20，并应该加入到已灭菌