第六章 抗体工程制药

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1、抗体工程制药2011年6月第一节概述第二节单克隆抗体第三节基因工程抗体第四节噬菌体抗体工程第五节转基因动物表达抗体第六节抗体工程在制药功业上的应用第一节概述一、抗体定义抗体（antibody，Ab）：指能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）:具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白IgAb化学结构上的概念生物学功能上的概念二、抗体工程发展历程1890年，Behring和北里柴三郎发现白喉抗毒素1937年，Tiselius等人用电泳法将血清蛋白

2、分为白蛋白、甲种（α）球蛋白、乙种（β）球蛋白、丙种（γ）球蛋白，并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分。1975年，KöhlerandMilstein等首次利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出McAb.在临床上主要用于诊断和治疗。1984年报道了人—鼠嵌合抗体多克隆抗体单克隆抗体基因工程抗体整体水平抗体生成技术细胞工程抗体生成技术基因工程抗体生成技术多克隆抗体（抗血清）单克隆抗体嵌合抗体、改形抗体“小型化抗体”（单链抗体）组合抗体库技术噬菌体抗体库技术Ig基因转基因小鼠抗体真核表达技术三、抗体分子的结

3、构与功能1、酶解片段木瓜蛋白酶(1)Fab段2个(2)Fc段1个胃蛋白酶(1)F(ab’)2段1个(2)Fc’段1个(1)Fab段2个　抗原结合片段fragmentwithantigenbinding(2)Fc段1个　可结晶片段fragmentcrystallized（1）Porter木瓜蛋白酶(1)F(ab’)2段1个结合颗粒性抗原出现凝集反应(2)Fc’段1个无生物学活性（2）Nisonoff胃蛋白酶（1）、轻链（lightchain，L链）214个氨基酸残基，24KD。分为：κ与λ2个亚型。

4、（2）、重链（heavychain，H链）450-550个氨基酸残基，55-75KD。分为5类，μ、γ、α、δ、ε链。IgM，IgG，IgA，IgD，IgE。2、重链和轻链3、可变区和恒定区（1）可变区（Variableregion，V区）L链N端1/2处（VL）110个aa;H链N端1/5-1/4处（VH）118个aa。互补决定区（complementarity-determiningregion,CDR），HVR1，HVR2，HVR3又分别称为CDR1，CDR2，CDR3骨架区（framewo

5、rkregion,FR）高变区（hypervariableregion,HVR）（2）恒定区（constantregion，C区）L链C端1/2处，105个aa;H链C端3/4-4/5处，331-431个aa。在同一种属动物中是比较恒定的,是制备第二抗体进行标记的重要基础。4、功能区链内二硫键折叠成球形区称为功能区，约由110个aa组成。（1）L链：2个，VL，CL各1（2）H链：IgG，IgA，IgD：4个（V区1个，C区3个）IgM，IgE：5个（V区1个，C区4个）（3）功能区的作用：（a）

6、VL和VH：结合抗原决定簇（FV区）（b）CL和CH：具有同种异型的遗传标记（c）CH2：结合补体（d）CH3：结合Fc受体单核细胞，巨噬细胞，粒细胞，B细胞，NK细胞C+V2Fab+FcF(ab’)2+Fc’V=FR+HVR=FR+CDRC=CL+CH1+CH2+CH3Ab=CDR1CDR2CDR3第二节单克隆抗体McAb是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的。由于这种抗体是针对一个抗原决定族的抗体，又是单一的B淋巴细

7、胞克隆产生的，故称为单克隆抗体。一、单克隆抗体制备过程注射抗原B淋巴细胞骨髓瘤细胞细胞融合、筛选杂交瘤细胞细胞培养筛选，继续培养足够数量的、能产生特定抗体的细胞群体外培养（注射到小鼠腹腔）体内培养单克隆抗体传统抗血清抗原免疫所有抗体混合123412341234脾脏淋巴結B細胞多克隆抗体制备过程1234mmmm12341234单抗细胞融合取出脾細胞+癌細胞各抗体分开单克隆抗体制备过程1、抗原与动物免疫抗原：颗粒性抗原和可溶性抗原免疫动物：BALB/c小鼠或Lou大鼠免疫方法：体内免疫和体外免疫2、细

8、胞融合与杂交瘤细胞的选择培养基本方法：取适量脾细胞（1*108）与骨髓瘤细胞（2*107~3*107）进行混合，在PEG作用下诱导它们融合，时间控制在2min以内，然后用培养液将PEG融合液缓慢稀释用于细胞融和的骨髓瘤细胞应具备融和率高，自身不分泌抗体，所产生的杂交瘤细胞分泌抗体的能力强且长期稳定等特点。PEG的相对分子质量和浓度越大，其促融和率越高。但其黏度和对细胞的毒性也随之增大。常用浓度为40%~50%，相对分子质量4000为佳。相对分子质量在400~6000，浓度在10%~