抗体工程要点.ppt

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1、抗体工程抗原的来源生物组织纯化蛋白的纯化方法：1.离子交换2.凝胶过滤3.亲和层析4.输水作用层析等。抗原的来源人工合成（化学方法）1.半抗原的合成2.抗原多肽的合成：多肽合成仪抗原的来源蛋白的重组表达1.原核细胞的表达方法：大肠杆菌，枯草杆菌。2.酵母细胞的真核表达方法：甲醇毕赤酵母的重组表达。3.昆虫细胞的表达：杆状病毒表达载体。4.哺乳动物细胞的表达：CHO，HEK293。5.抗原的单独表达和融合表达。6.表达标签（TAG）：Fc标签，HIS标签，FLAG标签（DYKDDDDK），C-MYC标签，GST标签等。原

2、核表达系统质粒：1.多克隆位点（MCS）2.抗性基因3.启动子（P）4.复制起始位点（Ori）原核细胞的表达操纵子表达模型与启动子：酵母真核细胞表达系统酵母表达系统的优缺点：操作简便。表达量高。培养条件简单。易于纯化。N-端可能会有氨基酸缺失。存在过量糖基化的可能。昆虫杆状病毒表达系统哺乳动物细胞表达系统稳定表达细胞系：CHO细胞瞬时表达细胞系：293细胞载体：原核载体骨架真核启动子增强子多克隆位点PolyA信号真核细胞筛选标志加压筛选基因哺乳动物细胞表达系统的特点可以分泌表达，活性高。纯化步骤可能比较复杂。糖基化比较

3、正常。成本较高，表达量偏低。周期较长。可以建立无血清培养的方法。第三章抗体分子的结构和分类CDR区：互补决定区FR区：框架区重链分子量：450-550个氨基酸残基构成，45-70kd轻链分子量：大约214个氨基酸残基构成，22-24kd抗体分子片段抗体分子的分类IgA和IgM的J链，IgA的分泌片IgG：1,2,3,4.bacteriaAb+antigenaggregatesareingestedbyphagocyticcellsvirusesTheycanrecognize:CancercellsProteins,c

4、arbohydrates,smallmolecules,etc,etc.Antibodiestendtoaggregatetheirtargets(viruses,cells)(proteins)Whatcanantibodiesdo?Xenotransplantation,Autoimmunodiseases特殊的抗体分子卵黄抗体IgY：由两条重链（H）和轻链（L）组成，重链（υ）由一个可变区（V）和4个恒定区（C）组成，没有铰链结构。完整分子量为180KDa（7.8S），重链为67－70KDa，轻链为25KDa，但

5、还存在一个小体积副本，120KDa（5.7S），发现于野鸭和某些龟类中。克隆IgYH链表明，较小的IgYH链缺乏C3、C4区，称为IgY（△Fc）单域抗体特点：1.见于驼类动物，软骨鱼类2.没有轻链多肽。3.CDR3区较长。4.驼类单域抗体没有CH1.5.去除Fc片段后称为纳米抗体。抗体的生物学功能特异性的结合抗原激活补体结合Fc受体1）调理吞噬作用：巨噬细胞。2）介导过敏反应：肥大细胞。3）ADCC作用：NK细胞、单核细胞。4）穿过胎盘和粘膜5）免疫调节。抗体的来源抗体的定义抗体的发现：1888年EmileRoux和

6、AlexanderYersin发现了白喉毒素，1890年VonBehring发现，白喉毒素或者破伤风毒素免疫动物后，血液中可以产生阻止毒素诱发疾病的物质，称为抗毒素（antitoxin)。电泳分析gamma球蛋白（并不全是抗体）1972年世界卫生组织和国际免疫学联合会把具有抗体活性及化学结构与抗体类似的一类球蛋白，统一命名为免疫球蛋白（immunoglobulin)。人血清球蛋白的电泳图谱白蛋白a1a2bg白蛋白a1a2bg抗体生成的理论1897年，PaulEhrlich提出了侧链学说，他认为细胞表面有特异性受体分子，

7、可以释放的血液里面，就是抗毒素（抗体）。1930年，Breinl和Haurowitz提出模板学说，认为抗原是抗体合成的模板。1955年，Jerne提出天然抗体选择学说，抗原抗体的复合物刺激细胞产生更多针对该抗原的抗体。1958年，Macfarlane，Burnet，DavidTalmadge和Joshua提出了克隆选择学说，每一个产生抗体的细胞克隆（B细胞）只能产生一种抗体，抗原与B细胞表面的膜型抗体分子结合，刺激B细胞的增殖分化，浆细胞，生产更多的抗体。Clonalselectiontheory细胞凋亡（apopto

8、sis：Caspase）细胞自噬（autophagy：溶酶体）人体内可以产生10E12以上不同的抗体分子，为什么？第四章抗体的基因及其表达抗体重链基因簇（IgH):14号染色体，1.5Mb抗体轻链Kappa基因簇（IgK）：2号染色体，800kb。抗体轻链Lamda基因簇（IgL）：22号染色体，700kb)。抗体重链的基因及其表