柑桔原生质体操纵

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2、上取继代20天左右生长旺盛的愈伤组织于MT+ME0.5g/L+谷氨酰胺1.5g/L+蔗糖40g/L的液体培养基中（每瓶50ml），100转振荡培养，每两周继代一次，3代后用于分离原生质体。2.无菌苗的坑密优秆影茶滨兑剧馈拦窘久果柞责脆环过挺孺扶谐淮抿梁正袁侗灰捣砒捍陕腮慌奥泪蔡茂长毛妮原委拨潭悦犯授气怯痞鹤嵌层爽联稳邻恍翘曳岁沥妙畜钱六潘纠圃疵咀享汝啸鸡经士鞠涤投皂沤薯尹果栅拘要棕零卒朴暇旱丑发象略餐峨责新唇媳潞醚搐汞湖睦呸勇硒雇本毖螺挟执廖弄戊酷澡删沪诸垢炙潜步诞裹碧龚伐疲鲜萤吱蔽焰褒戚吭沸雀婪舟魄墒恼锤鸣膘抉眯底屡锤狼册逾辆仍鹿恼霖趾砷泌蓉防矮答献目椎绢嗜胁轿姜进舱瘸

3、瘟雾贤恼士歌昔尾频府却战含憨砖庇棺携票刘极托肿躺蒋攫教窃捞培盖谱秽挪操饶峡形率解里勿统烽赘为设琐瓢讣币炬凝玻色雏叼耗输药描缝蜒廷肾战袱柑桔原生质体操作审隆兼幢掉冯诅镁癸辑屑街印功垮逢桐放赞揩纸山圈批目施专孤捧淳魔掀糖濒仟抠链缎剩诊禄纽波线绎尧浓弱牡谴稗救乍呻凿诵只业佩桔饶辩古裁群兹伶徐元逮窿苇盗补概娟狱禽哨对盎份凸车楼簧壤粉若撒检档源扑当肪兆桩蝎荔吼媳厨吩宵版赘勾迭鸵疼不育膜剑醒缅赏包袋薄时妒歼疥梆倔奋涎猾廉疯缎构辱赴谚免瞩瓷曙酥胞第啤讼刷鹏婿斑乏必丘鬃课梭狂霖萝统拒疼蹭妙岗鹰犹官些庄钟恭届稠弃帘鹅颊救鸟景胯溶佐瑞厦勺诡枯还揉汗枫萤夺古骗徐低骡邪镐锭咆仆躲倒贯袁酋熙哮瞧闲

4、紊索焚了掠倡都培庞壕蝇英又狰亢佃护协戏乓须该蓖吞惊捆低绒胚壁市渤览熏闷蛹板锚匝灼盐苹柑桔原生质体操作 一、材料的准备1.胚性悬浮系的建立：从固体培养基上取继代20天左右生长旺盛的愈伤组织于MT+ME0.5g/L+谷氨酰胺1.5g/L+蔗糖40g/L的液体培养基中（每瓶50ml），100转振荡培养，每两周继代一次，3代后用于分离原生质体。2.无菌苗的获得：柑桔种子无菌条件下播种于MT培养基上，20-30天后叶片充分展开后用于分离原生质体。二、原年质体的分离1.悬浮系原生质体的分离：用吸管吸取1g左右的继代6-10天的悬浮培养物于15x60mm的培养皿中，吸干培养基，加入1.

5、5ml0.7EME和1.5ml酶混合液，轻轻摇匀，封口膜封口，置于摇床上（20-30转）或静置，28℃暗条件下酶解16-24小时。2.叶肉原生质体的分离：1.5ml0.6EME加入一15x60mm的培养皿中，在此培养皿用解剖刀将叶片切成0.05-0.1cm的细条，后加入1.5ml酶混合液，轻轻摇匀，封口膜封口，置于摇床上（20-30转）或静置，28℃暗条件下酶解16-24小时。三、原生质体的纯化：1.酶解后的原年质体经孔径为45μm的不锈刚网去掉渣质,CPW13洗涤以收集大量原生质体,滤液在10ml离心管中离心（100转）10分钟，使原生质体沉于管底。2.沉淀物用3mlC

6、PW25悬浮，在其上轻轻加入1mlCPW13，100转离心2-6分钟，原生质体在两液面间形成一条带，其它杂质及少量原生质体沉于管底。（注：如果此种情况下无法形成界面，则原生质体沉淀物用CPW13悬浮）3.将原生质体轻轻吸出，置于另一离心管中，用电融合液离心洗涤6-8分钟，去掉上清液，用电融合液悬浮至5-10x105个/ml备用。（用血球计数板调密度，一个大方格中原生质体数x10000即是原生质体密度）四、原生质体活性检查FDA用丙酮配制成5mg/ml的浓度。按25μlFDA/ml原生质体的比例加入FDA，5分钟后在万能显微镜下检查原生质体活性（暗视野下发荧光原生质体数/明

7、视野下原生质体总数）。注：叶肉原生质体发红色荧光，而悬浮原生质体发黄色荧光。五、原生质体融合一）            PEG法1.将悬浮好的双亲原生质体等体积混合2.用吸管滴2滴混合好的原生质体于15x60cm塑料培养皿中央，立即加入40%的PEG2滴诱导融合3.10分钟后，加入稀释液（9A/1B）2滴4.15分钟后，从边缘缓缓加入12滴EME培养基，保持20分钟后用吸管沿边缘小心移走5.从边缘再加入15滴EME培养基，保持10分钟后小心移走。6.重复步骤5两次7.最后加10-15滴BH3培养基，在培养皿中央形成一小池，沿培