黄芪纳米粉激活细胞端粒酶活性及细胞寿命的影响

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1、黄芪纳米粉激活细胞端粒酶活性及细胞寿命的影响刘晓燕王九颂1．提要：目的：探讨黄芪纳米粉对激活端粒酶及延缓细胞衰老的作用机制，为黄芪纳米粉延缓衰老的研究开辟新的领域。方法：黄芪纳米粉作用于人衰老型细胞，观察细胞生长分裂次数，生物化学染色方法鉴定细胞的衰老，再测定细胞前后端粒酶活性的变化。结果：黄芪纳米粉作用细胞后，能够明显促进细胞群体分裂倍增次数，衰老型细胞数量显著下降；测试后端粒酶活性明显上升。结论：黄芪纳米粉很可能是通过激活细胞内端粒酶活性，使端粒酶重新开始工作，重新开始弥补端粒缩短DNA碱基对（bp）而继续增长端粒，从而增加细胞分裂次

2、数及细胞活力。延缓了细胞的衰老。端粒酶再激活是细胞逃脱衰老的重要机制，也表明端粒酶在细胞生物钟中具有重要作用。关键词：黄芪纳米粉端粒端粒酶细胞衰老端粒生命时钟的发现，是生物学的大事件。近年发现细胞衰老与细胞内染色体端粒长度正相关。人类细胞的分裂潜力由细胞内染色体上端粒的长度决定。通常认为当端粒因分裂而缩短到临界长度时，细胞就停止了分裂。而端粒结构是由端粒酶来维持的，这是细胞的重要生命现象之一。正常细胞的分裂能力有限，当其经过一定的倍增之后，将进入衰老状态，称为为细胞衰老。从分子水平研究细胞老化及人类的衰老，是目前研究生物衰老机理的方向。本

3、文通过测定黄芪纳米粉作用于人成纤维细胞后，细胞生长速率的变化、衰老细胞数目改变、端粒酶活性等方面，初步揭示了黄芪纳米粉延缓细胞衰老和端粒酶活性的关系。1材料和方法1．1材料黄芪纳米粉为本室准备；ECL试剂盒，X—gal为Promega公司产品；端粒酶活性检测用TRAP—ELISA试剂盒，Roche公司产品：TRIZOL试剂，DMEM培养基为Gibco公司产品；小牛血清为Hyclone公司产品；其他试剂均为进口和国产分析纯试剂，1．2方法1．2．1细胞培养细胞系来自^、胚肺组织，为二倍体成纤维细胞。体外培养最多可分裂60-70代。一般认为3

4、0代以下为年轻细胞，55代以上为衰老细胞。用含10％d~牛血清、100units／ml课题由学校生物学基金资助青霉素和100pg／ml链霉素的DMEM培养液培养。1．2．2细胞处理待细胞处于生长对数期时(50～60％细胞融合)，细胞用DMEM洗一次后，加入相应体积的含10％小牛血清DMEM和黄芪纳米粉，使得黄芪纳米粉的最终浓度分别为10、20、40、80、120mg／N，无黄芪纳米粉的细胞为对照。1．2．3生长曲线接种5000个衰老型成纤维细胞于96孔培养板中，按上述方法培养与黄芪纳米粉作用，每48小时计数1次，连续8天，绘制细胞生长曲线

5、。1．2．4一半乳糖苷酶(p—gN)染色按Dimfi等建立的方法进行_6。将成纤维细胞接种于盖玻片上。在黄芪纳米粉作用于不同时间后，PBS洗一次，用40g／L多聚甲醛固定细胞45min，用X一半乳糖苷酶(X一)染液，37℃保温4～8小时。染液含20mn~l／LX一、40mmol／L醋酸一磷酸钠(pH6．0)、5mn~l／L铁氰化钾、5mmol／L亚铁氰化钾、150mn~l／L氯化钠、2mn~l／L氯化镁。室温显色过夜。衰老细胞呈深蓝色，显微镜下计数。1．2．5TRAP—ELISA实验用TRAP—ELISA试剂盒进行实验，方法见试剂盒说明书

6、。收集细胞，PBs洗一次，每管2×10个细胞，加入20@1裂解液，冰浴30min后，4℃16000g离心20min，取上清紫外蛋白定量。每管加入约5的细胞裂解液，25出混合物，5l内标引物，用无DNAase的水补至50~；25℃反应30rain，然后加热94℃，灭活5min后进行PCR反应，条件为：变性94℃30S，50℃30S，72℃90S，循环数20，最后保温10min。取样品和内参对照PCR产物各2．5l于96孔板上，同时设空白裂解液和样品灭活的对照，每孔加入10出变性液，室温10min，样品一分为二，分别加人10@1杂交液T或10

7、@1杂交液IS，混合后，加入预处理过的96孔板中，封口，37℃300rpm2hr；吸去杂交液，用洗涤液洗3次后，加入100I山ti—DIG—m工作液，300rpm，室温30min；去杂交液，洗5次，加入100~ITMB底物溶液，300rpm室温20min；最后加人100终止液，在30min内在450nM处测其光吸收值，按公式计算端粒酶的相对活性。结果2．1黄芪纳米粉对细胞生长的影响黄芪纳米粉作用于衰老成纤维细胞(浓度为120rag／d1)，不同时间后，消化细胞，进行计数，绘制生长曲线。如图1所示，黄芪纳米粉给药后，与对照组细胞相比，细胞的

8、群体数目明显增多，且随着给药时间的延长，其作用越显著。结果说明，黄芪纳米粉可以增强衰老型成纤维细胞的增殖能力，延缓细胞老化。图1不同时间下黄芪纳米粉对衰老细胞增殖的影响2．2黄芪纳米粉对细胞衰