bcl┐2核酶对smmc7721细胞端粒酶活性的影响作用

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1、bcl┐2核酶对SMMC7721细胞端粒酶活性的影响作用　　摘要:目的观察bcl-2核酶对SMMC-7721细胞的作用，探讨bcl-2表达水平的改变对细胞端粒酶活性的影响.方法经脂质体介导的方法将PMTr-neo（正向bcl-2核酶真核表达载体）导入SMMC7721细胞中，细胞克隆转移扩大培养后，采用TUNEL，TRAP-PCR-ELISA，免疫组化技术结合图像分析技术检测SMMC7721/PMTr-neo细胞凋亡、细胞端粒酶活性及P16，P21的改变.结果较对照组SMMC7721/PMTr-neo细胞Bcl-2表

2、达水平显著下降，伴有显著细胞凋亡现象;同时端粒酶活性下降，P16，P21表达水平显著增加.结论bcl-2核酶可促进SMMC7721细胞发生凋亡，并降低细胞端粒酶活性，提示Bcl-2表达水平的改变对细胞端粒酶活性有一定的影响.　　Keys;bcl-2;ribozyme;apoptosis　　Abstract:AIMToobservetheeffectofbcl-2ribozymeonSMMC7721cellsandtoinvestigatebcl-2expressiononcellu-larapoptosisandt

3、elomeraseactivity.METHODSPMTr-neo（sensebcl-2ribozymeeucaryoticexpressionvector）edia-tion，aftercloningTUNELandTRAPinbinationofELISAandIHCinbinationofimaginganalysisineSMMC7721/PMTr-neoapoptosisandtelom-eraseactivity.RESULTSparedarkableapoptosisandtelomeraseacti

4、vity.CONCLUSIONbcl-2ribozymepromotesapoptosisofSMMC7721cellsandreducestelomeraseactivity.Theseprovideatheoreticalbasisforapplyingantisensetechniquetotreatmentofhepatocarcinoma.　　0引言　　抗凋亡蛋白Bcl-2在肿瘤发生过程中有着重要意义.自从Vaux首次证实bcl-2高表达可以诱发肿瘤后，人们对其进行深入研究，发现bcl-2可以抑制细胞凋亡

5、、延长细胞生存期［1-3］人们对bcl-2与肝癌的关系也进行了探讨，认为它与肝癌的发生也存在密切关系.目前有关核酶的研究在生物学领域中已成为新的热点:一方面可以利用核酶来研究特定基因的功能，因而其在基因表达调控研究中倍受重视;另一方面将核酶应用于基因治疗较其他反义技术具有更多优点.在肿瘤治疗方面，人们也开始有益的尝试，希望核酶能为肿瘤治疗提供新的有效手段.我们采用脂质体介导的基因转移方法，将bcl-2核酶导入人肝癌细胞株SMMC7721细胞中，结合TUNEL，TRAP-PCR-ELISA及免疫组化等技术观察bcl-

6、2核酶对SMMC7721细胞的影响，为肿瘤基因治疗提供理论依据.　　1材料和方法　　1.1材料大肠杆菌JM109由本校生物化学教研室惠赠;PMTr-neo质粒（含bcl-2核酶）由彭玮丹博士构建［4］;核酸内切酶购自Promega公司;脂质体转染试剂盒购自Gibico公司;凋亡检测试剂盒购自BoehringerMannheim公司;SMMC7721细胞由本室保存培养.　　1.2方法　　1.2.1PMTr-neo转染SMMC7721细胞①PMTr-neo质粒的鉴定:将PMTr-neo质粒转化JM109大肠杆菌，扩增提

7、取质粒，经核酸内切酶BamHI，EcoRI双酶切后，电泳鉴定bcl-2核酶片段大小正确.②PMTr-neo转染SMMC7721细胞:把处于对数生长期的SMMC7721细胞分为两组:对照组（SMMC7721细胞）、实验组（转染PMTr-neo的SMMC7721细胞），转染方法按脂质体转染试剂盒操作步骤说明进行，培养48h后传代，加入含G418550mgL-1的培养液，筛选抗性细胞.继续培养2olL-1硫酸锌诱导bcl-2核酶表达.48h后，丙酮固定，免疫组化检测.Bcl-2单抗购自博士德生物公司，免疫组化按照DAKO

8、公司Envi-sionTM+System，HRP试剂盒说明进行.免疫组化检测步骤如下:①30mLL-1H2O2甲醇封闭30min;②3mLL-1BSA封闭30min;③加一抗4℃过夜;④加DAKOEnvisionTM+System，HRP，mouse，（R4001）;⑤显色，苏木精衬染封片.以上步骤均用PBS缓冲液洗涤，光镜下观察结果.同时设立对照实验.