htert激活人骨髓间充质干细胞端粒酶活性

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1、hTERT激活人骨髓间充质干细胞端粒酶活性【摘要】明确外源性人端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase，hTERT)能否激活人骨髓间充质干细胞(humanbonemarroesenchymestemcell，hBMSC)的端粒酶活性。［方法］培养人骨髓间充质干细胞，采用脂质体转染法，将编码hTERT基因的真核表达质粒pCIneohTERT导入单克隆培养的人骨髓间充质干细胞。利用G418加压筛选，稳定后，用RTPCR检测hTERTmRNA的表达，SC).［Method］hBMSCidpCIneohTERT

2、encodinghTERT.AfterselectionRNAeraseactivityinuntransfectedandtransfectedcellsidpCIneohTERT.ThecellsbegantosuspendanddieafterthedayoftheG418selection.Atthetenthday,alltheuntransfectedcellslformaintainingselecting,atthetRNAandprotEInlevelintheseanti418cellclones,andmeaneraseacti

3、vityan'bonemarroesenchymecells,telomerasecouldbeactivatedbyexogenoushTERT.Thisisafoundationtoestablishimmortalizedhumanbonemarroesenchymestemcellline.Keyerase;humanbonemarroesenchymestemcell;gene髓间充质干细胞(humanbonemarroesenchymestemcell，hBMSC)目前作为组织工程的种子细胞，在基础研究与临床中得到广泛应用。但是也存在许多问题

4、［1～3］，在基础研究中存在如何得到纯化，甚至标准的细胞系，使各实验室之间以及实验室前后研究之间具有可比性和延续性的问题；在临床生物工程应用中存在细胞老化、去分化，以及生物工程化器官过程中，如何获得足够数量的种子细胞的问题［3］。细胞培养广泛应用于基础研究、临床实践和生物工程［4］。然而，正常组织来源的细胞在通常的体外培养条件下经过有限次的传代后，就会停止分裂增殖，发生衰老和死亡［5］，这就限制了细胞培养技术的进一步应用。因此，学者们提出建立永生化细胞系，使体外培养的细胞具有无限增殖能力。研究表明，端粒酶的激活可以延缓细胞的衰老，甚至使细胞永生化［6,7

5、］。TERT作为端粒酶的逆转录酶，与细胞端粒酶的活性高低密切相关［8］。本实验将外源性人TERT(humantelomerasereversetranscriptase，hTERT)基因转染至克隆培养的hBMSC中，以明确hTERT能否调控其端粒酶活性，为建立永生化人骨髓间充质干细胞系奠定基础。1材料和方法1.1主要试剂与材料LDMEM低糖培养基，胰酶，限制性内切酶EcoRI、SalI，Midi质粒纯化试剂盒，G418：均为美国GibcoBRL公司产品；胎牛血清为美国Hyclone公司产品；LipofectAMINE2000转染试剂盒：美国Invitr

6、ogen公司；端粒酶活性检测试剂盒：华美生物工程公司；质粒pCIneohTERT(hTERT基因克隆至真核表达载体pCIneo，酶切位点EcoRI和SalI)美国学者INE2000转染试剂盒说明书进行pCIneohTERT的转染。24h后1∶10传代，次日加G418，浓度为200μg／ml。经过9～10d，未转染组细胞在G418作用下全部死亡，此时将G418浓度降为100μg／ml，继续培养，20d左右出现明显细胞抗性克隆。在显微镜下用含胰酶的10μl移液枪转移至24孔板扩大培养。取转染前及转染后第10、25代细胞进行以下实验。1.2.3hTERTm

7、RNA的表达用Trizol裂解沉淀细胞后，提取总mRNA。根据hTERT的mRNA序列(GeneBank)和参考2.2细胞培养和基因转染细胞转染质粒pCIneohTERT后，生长状态良好。加G418后第2d，细胞开始悬浮，逐渐死亡。第10d，未转染组细胞在G418作用下全部死亡，转染组细胞开始克隆增殖。G418浓度降至100μg／ml维持筛选，20d左右开始出现明显抗G418细胞克隆(图2)，用移液枪转移，扩大培养。图2转染后BMSCs的G418抗性克隆形成17d观察2.3hTERTmRNA的表达转染后第10、25代细胞的总RNA经RTPCR后可获得

8、约175bp的特异性片段，表明细胞在mRNA水平上表达hTERT(图3)。2.4