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《无淀粉麦麸为底物体外植酸酶活性评价方法的建立》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、植酸酶活性评价方法的建立[摘要]为提高体外检测方法的科学性和客观性,预测植酸酶在动物体内的活性和作用效果,研究以无淀粉麦麸为底物,探索并建立了一种更为客观评价植酸酶活性的检测方法。与现有的植酸酶酶活测定国家标准相比,在不同pH值的缓冲液中检验植酸酶降解天然植酸的效果,具有更为科学、客观与简便等优点。[关键词]植酸酶;无淀粉麦麸[Abstract]Inordertoevaluatephytaseactivitymorescientificandaccurate,anewmethodwasproposedbydetectingphosphatereleasingatdif
2、ferentpHbufferusingnon-starchwheatbranassubstrate.Comparedwiththepresentnationalstandardmethod,thisnewmethodismorescientific,accurateandconvenient.[Keywords]phytase;non-starchwheatbran植物性饲料中的植酸酶由于能够降解植酸并释放出其中的磷和所结合的氨基酸与微量元素而广泛应用于饲料添加剂(陈文等,2005;Spencer等,2000)。随着植酸酶在饲料中的广泛应用,对植酸酶活性评价方法的需求
3、也越来越迫切(陆文清等,2004)。目前,植酸酶的活性评价主要以植酸钠为底物,这种方法存在以下几方面的缺点:首先,饲料成分相对复杂,纯化的植酸钠不能模拟植酸酶在体内作用时所面对的复杂底物成分;其次,植酸酶进入体内胃内的酸性环境,目前方法所选择的pH5.5并不能体现植酸酶在该阶段的作用效果。为了进一步提高体外检测方法的科学性与客观性,本研究拟以植物性饲料无淀粉麦麸,增加活性评价时的pH梯度和处理时间,进而建立一种更为客观评价植酸酶体内活性的检测方法。1材料与方法1.1材料待测植酸酶,三水乙酸钠,植酸钠,浓盐酸,Tween20,胃液,无淀粉麦麸。1.2仪器全自动分光光度计
4、,水浴锅,离心机,分析天平等。1.3方法与步骤1.3.1标准曲线的制备参见国家标准GB/T18634-2002。1.3.2无淀粉麦麸的制备称取200g麦麸,加入2000mL浓度为0.1mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH6.0),在40℃浸泡6h。用不锈钢筛网(20目孔径)过滤,取滤渣,用蒸馏水浸泡、冲洗3次,充分清洗麦麸中的淀粉和可溶于水的小分子物质。在80℃气流干燥6h至含水量不超过8.0%。1.3.3酶缓冲溶液的制备参见国家标准GB/T18634—2002,配置pH2.5和5.5的0.25mmol/L醋酸-醋酸钠缓冲液。1.3.4植酸酶测定无淀粉麦麸中的含磷量分
5、别准确称取2g无淀粉麦麸分别加入有200mLpH5.5和pH2.5缓冲酶液的三角瓶中,摇匀,于37℃水浴锅中反应,每1h取样1次,每次取6mL再加入4mL的钒-钼酸铵比色液比色,在此过程中,随着反应时间的延长,磷的释放量的增多,会出现颜色过深,当吸光度值超过1,则需加大酶液的稀释倍数,再进行比色。根据比色的结果计算反应后液体中的含磷量,最终以反应时间为横坐标,释放出来的磷为纵坐标,分别绘制两个pH时,在植酸酶的作用下磷释放量随反应时间的变化曲线。1.3.5新鲜胃液的制取从屠宰场取生长猪的新无淀粉麦麸为底物体外鲜的胃(2~3个),将猪胃割开,用4~6层纱布将胃内容物过滤
6、,收集滤液。1.3.6测定胃液中酶活损失准确移取新鲜胃液500mL于反应瓶中,向其中加入2.5g待测植酸酶,立即取出25mL放于三角瓶中,测定其酶活,将剩余的反应液置于37℃的水浴锅中反应,每半小时取样1次,得到胃液条件下植酸酶活性变化的曲线。2结果与分析2.1以无淀粉麦麸为底物评价植酸酶的活性2.1.1无淀粉麦麸最适添加量的确定为了确定无淀粉麦麸的最佳添加量,试验中分别设定底物量为0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%,然后用不同添加量的底物进行植酸酶反应,结果显示,在浓度为0.5%时,反应到4h后就不再释放磷,说明底物量不足;而当底物浓度大于1%时,在反应7h后
7、用钒-钼酸铵比色,磷的浓度就过高;只有当底物浓度为1%时,能保证向底物中添加植酸酶后的12h磷的释放量随反应时间逐步增加(试验设定反应时间为最长12h)。由此可见底物浓度为1%是最适宜的底物添加量。2.1.2不同pH条件下磷的释放量随植酸酶处理变化规律的研究见图1。图1结果表明,在两个pH下磷的释放量都逐渐增加,此外pH2.5比pH5.5的条件下磷的释放量更多,说明此酶在pH2.5的条件下具有更高的活性。2.2胃液条件下植酸酶活性的变化情况见图2。由图2可以看出,在新鲜胃液中,随着反应时间的延长,植酸酶活性有所下降,但下降程度不是很大。3讨论植酸酶酶
