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《植酸酶活性测定应注意的几个问题》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、刘小春1温度植酸酶作为一种酶制剂，对温度非常敏感，温度低会降低它的生物活性；温度高也会降低其生物活性，甚至完全失活。因此，在检测过程中对温度的控制则显得非常重要，国标要求植酸酶活性测定时的温度为（37±0・1）°C。在33°C吋植酸酶不能很好地发挥其活性，酶活与其真实值相比约低10%；在40°C时，部分植酸酶会失活，酶活与其真实值相比约低8%。另外，水浴加热时，水浴液面要超过试管内反应液液面，使其在规定时间内充分反应。2pH值pH值在酶活测定吋影响很大，国标要求pH值为5.5。当pH值为3.0时，植酸酶活力基本消失。尽量不耍用酸度计来调节缓冲液的pH值，因
2、为酸度计存在一定的误差，使用时间长了会发生钝化，使测定的pH值不准。可以通过计算缓冲溶液屮H+浓度的方法来配制一定pH值的溶液。如①配制0.25mol/l乙酸缓冲液，加入34.02g三水乙酸钠、2.78ml浓盐酸，完全溶解后定容至1000ml,用精密pH试纸测定溶液pH值为5.0。笔者曾用酸度计对照，配制上述pH值溶液需加入浓盐酸6ml,1：3盐酸约20ml,此溶液pH值实际上已经低于5.0,由此说明此酸度计已经反应迟钝。②配制0.25mol/kpH值5.50的乙酸缓冲液，需加入34.02g三水乙酸钠、刘小春1温度植酸酶作为一种酶制剂，对温度非常敏感，温度
3、低会降低它的生物活性；温度高也会降低其生物活性，甚至完全失活。因此，在检测过程中对温度的控制则显得非常重要，国标要求植酸酶活性测定时的温度为（37±0・1）°C。在33°C吋植酸酶不能很好地发挥其活性，酶活与其真实值相比约低10%；在40°C时，部分植酸酶会失活，酶活与其真实值相比约低8%。另外，水浴加热时，水浴液面要超过试管内反应液液面，使其在规定时间内充分反应。2pH值pH值在酶活测定吋影响很大，国标要求pH值为5.5。当pH值为3.0时，植酸酶活力基本消失。尽量不耍用酸度计来调节缓冲液的pH值，因为酸度计存在一定的误差，使用时间长了会发生钝化，使测定
4、的pH值不准。可以通过计算缓冲溶液屮H+浓度的方法来配制一定pH值的溶液。如①配制0.25mol/l乙酸缓冲液，加入34.02g三水乙酸钠、2.78ml浓盐酸，完全溶解后定容至1000ml,用精密pH试纸测定溶液pH值为5.0。笔者曾用酸度计对照，配制上述pH值溶液需加入浓盐酸6ml,1：3盐酸约20ml,此溶液pH值实际上已经低于5.0,由此说明此酸度计已经反应迟钝。②配制0.25mol/kpH值5.50的乙酸缓冲液，需加入34.02g三水乙酸钠、1.24ml浓盐酸，完全溶解后定容至1000ml,用精密pH试纸测定溶液pH值为5.50o3底物植酸钠的型号
5、植酸钠有两种型号，一种是Sigmap-3168,分了量为923.8；另一种是Sigmap-8810,分子量为660.03。根据国标要求，植酸钠应为Sigmap-3168,笔者在实验中发现Sigmap-3168植酸钠底色浅,且作磷标准曲线吋梯度较好（见表1、表2）o表】以Sign-iap-3]68为虑觀不同璘浓度对媒龙度的夥响臓度（ruru口1"）2512.56.253.1251.5625吸光度0.7^903930.2000.0350.036由表1、表2可以看出检测植酸酶活性时用Sigmap-3168为反应底物较好。耒2叹Sigmap-S8]O为虑物不同璘浓
6、•虞对披龙虞的夥响暁浓度（亦口VI）2512.56.253.1251.5625吸光度03740.1760.0740.0304离心速度和时间当水浴30min终止酶解反应后，需要进行离心。国标要求4000r/min,离心lOmin。若以3000r/min离心lOmin,则离心不彻底,测吸光度时发现标准曲线吸光度不呈梯度；以5OOOr/min离心lOmin时,发现标准曲线各梯度的吸光度与以4OOOr/min离心lOmin时相比偏低。如果应用国标改进法，乙酸缓冲液中加入了牛血清白蛋口，离心吋间需要15mino笔者曾用国标改进法进行了吋间对比实验，测定酶活时离心lO
7、min和15min后样品的吸光度（见表3）。表3不同飄心时间对杭酸晦检糾结杲的夥响顷目寫询间（ruin）吸光度测宦结果（15一訓酸翻100J31033150.112306二导检酸酸100.0259415OJ337246由表3可见，离心时间对测定结果影响很大。5公式换算在整个实验过程中即使做得再成功，若公式换算出错，将会前功尽弃。植酸酶绝对法测定酶活时，计算公式如下：植酸酶活性（LVg）=njx30式中：C——根据实际样液的吸光值由曲线刨归方程计算出的y值(U)；F——试样溶液反应前的总稀释倍数；m试样质量（g）；30——反应时间（min）o其中F所代表的总
8、稀释倍数换算吋容易出现错误，现在我们举例说明：称取500IU植酸酶
