饲料原料为底物_植酸酶体外磷释放量的一种快速测定方法.doc

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1、饲料原料为底物，植酸酶体外磷释放量的一种快速测定方法目前，植酸酶作为饲料添加剂在饲料工业中的应用已经非常广泛，不仅应用于猪和家禽饲料中，而且在水产饲料中的应用也较为广泛。在饲料中添加植酸酶是一种提高动物利用饲料原料中植酸磷能力的有效途径。不论是3-植酸酶（肌醇六磷酸3-磷酸水解酶）还是6-植酸酶（肌醇六磷酸6-磷酸水解酶），都可以有效地从底物中释放出磷。通常情况下，植酸酶先按照设计比例添加于动物日粮，再调整磷酸氢钙添加量。因此，正确评估植酸酶释放无机磷的能力具有十分重要的意义。目前，国内有多种植酸酶活性测定方法，包括国标（GB/T18634-

2、2002）和不同企业标准，但均有一个共同特点：以植酸钠纯品（Sigmap-0109或p-8810）为底物评估酶活。下面着重介绍以饲料原料为底物，快速测定植酸酶体外释放磷的方法。1材料与方法1.1试剂及仪器参照GB/T18634-2002。1.2底物制备将常用饲料原料底物如豆粕、玉米、菜籽粕、棉粕和麸皮分别粉碎至大约60目，按照饲料配方中常用的比例配制两种不同比例（表1）的配方，将其混和，充分搅拌均匀。表1底物饲料配方原料底物1底物2玉米65%62%豆粕20%20%棉粕2%6%菜籽粕1%3%麸皮5%4%植酸磷含量0.28%0.22%总重930g

3、950g1.3酶样品来源本试验采用的植酸酶产品来自两种不同厂家的植酸酶产品。酶活保证值：样品1为5000U/g；样品2为10000U/g。1.4标准曲线制备准确称取0.6804g在105℃烘至恒重的基准磷酸二氢钾于100mL容量瓶中，用乙酸缓冲液（0.25mol/L，pH5.5）溶解，并定容至100mL，浓度为50.0mmol/L。按表2的比例稀释成不同浓度，按照表3进行操作。标准空白为4mL乙酸缓冲溶液（0.25mol/L，pH5.5）与8mL终止液混合液。以无机磷浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，列出直线回归方程（y=ax+b）。表2标准溶液

4、稀释倍数序号稀释量/mL浓度/（mmol/L）10.5→83.12520.5→161.562530.5→320.7812540.5→640.3906251.5检测步骤与方法准备试管按照表3的反应步骤进行操作。首先根据植酸酶产品在饲料产品中的添加量向每支试管中加入饲料原料混合底物。目前大多数植酸酶活性大约为5000U/g以及在饲料中的添加量为100mg/kg左右，即添加酶活量为0.5U/g，则实验中向每支试管添加0.4g饲料原料混合底物。向每支试管中添加试剂的时间间隔必须一致，37℃水解1h；试管在摇床中45°斜放。表3反应步骤反应顺序样品/标

5、准样品空白1.每支试管称取0.4g饲料原料混合底物√√2.待反应液在37℃条件下预热5min√√3.加入待反应液4mL4mL（第2步）4.混合√√5.37℃摇床（250rpm）水解1h√√6.加入终止液8mL8mL（第1步）7.充分混匀√√注：样品空白在第一步加中止液以终止其反应。反应后在室温下静置20min，然后离心（4000r/min）10min，上清液以标准曲线的空白调零，在分光光度计415nm波长处测定样品空白（A0）和样品溶液（A）的吸光值，A-A0为实测吸光值。用直线回归方程计算植酸酶的活性。1.6重复性与检出限检验采用一种未知植

6、酸酶产品和表1中的底物2按照表3的测定步骤，每日做6个重复，连续进行3d测定本方法的重复性。根据目前植酸酶在饲料中的推荐剂量，在测定检出限试验中设定50、80和100g/t3个添加量，并按照表3的步骤进行实验。1.7实例分析随即选取6种饲用植酸酶产品，并编号1，2，3，4，5和6，然后按照表3中的试验步骤测定植酸酶产品从混合饲料原料底物中释放的无机磷量。1.8统计方法采用EXCEL表格统计RSD值，以及SPSS16.0单因素方差分析，利用Ducan进行多重比较，P<0.0.5时为差异显著。1.9计算和表示每克植酸酶释放无机磷的量为：P=C/m

7、×F×31/1000式中：P———植酸酶从饲料原料混合底物中释放的无机磷量，mg/g；C———根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的酶活性，U（即1μmol）；F———试样溶液反应前的总稀释倍数；m———试样质量，g；31———磷元素的摩尔质量，g/mol；1000———转换因子。两个平行样品的测定结果用算术平均值表示，保留整数。同一样品两个平行测定值的相对偏差不大于10%。2结果与讨论目前，植酸酶活性检测方法（国标GB/T18634-2002）已被大多数企业采用，同时不少研究报道对该方法进行了改进。已有研究发现，不同反应底物对植酸酶活性

8、测定具有明显影响，但鲜有以饲料原料作为反应底物的研究报道。植酸磷主要位于谷物的种子和谷皮中，因此植物细胞结构可能会影响植酸酶与植酸磷之间的反应，而以植酸钠纯品为底物