G-CSF的定点PEG化修饰-谭小军报告

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1、报告人：南京大学谭小军二〇〇八年十一月G-CSF的定点PEG化修饰G-CSF(粒细胞集落刺激因子)G-CSF生理功能促进造血干细胞向中性粒细胞增殖、分化动员成熟中性粒细胞从骨髓进入外周G-CSF的应用抗肿瘤化疗、放疗以及骨髓移植手术后重要的辅助药物G-CSF的应用现存问题体内半衰期短易被酶水解和肾脏清除多次注射引起不良反应PEG(聚乙二醇)具有良好的生物相容性无毒性无抗原性修饰后的蛋白和多肽类药物的药代动力学和药效学性质能够得到改善在国内外已经得到比较多的应用项目概要概括和总结现有蛋白质和多肽类药物的化学修饰方法；选用合适的PEG对重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）进

2、行选择性的定点修饰改善rhG-CSF的各项性能，例如延长其在人体内的半衰期，降低其免疫原性而尽量不影响其生物活性，提高其临床应用价值mPEG-PAL一端的甲氧基相对惰性G-CSF的Ｎ端氨基与侧链氨基的等电点差=〉mPEG-PAL另一端醛基在偏酸性条件下特异性地与蛋白质N端氨基发生反应mPEG-PAL（单甲氧PEG丙醛）最佳修饰反应条件的摸索！Figure1.SDS-PAGEanalysisoftheorthogonalsamplesstainedwithCoomassieBlue.Lane1-9:ninesamplesintheorthogonaltestscorrespon

3、dingtothetestnumber.正交实验确定最佳反应条件TheOptimalConditions:Time：48hourspH：5.0Temperature：20℃MolarratioPEG/rhG-CSF：10:1最佳条件反应结果Figure2.Muchmono-PEGylatedrhG-CSFwasobtainedundertheoptimalconditions(48h,pH5.0,molarratioofmPEGtorhG-CSF10:1;20℃),morethanundertheconditionsofTest5or7intheorthogonaltests

4、.AB放大反应分离纯化Figure3.Theprofileofcationexchangefastproteinliquidchromatogram(ÄCTAFPLC)ofthePEGylatedrhG-CSF.TheaveragemolecularweightsofmPEG-PALusedare(A)20kDaand(B)5kDa,respectively.PEG(5kD)-G-CSF纯品Figure4.TheFPLCprofileofPEG(5kD)-G-CSFafterpurification.PEG(20kD)-G-CSF纯品Figure5.TheFPLCprofil

5、eofPEG(20kD)-G-CSFafterpurification.Mono-PEG-G-CSF纯品LANEA:MarkerLANEB:Mono-PEG(5kDa)-G-CSFLANEC:Mono-PEG(20kDa)-G-CSFLANED:G-CSFFigure6.SDS-PAGEanalysisofthepurifiedmono-PEG-G-CSFstainedwithCoomassiebrilliantBlue.Mono-PEG-G-CSF体外活性Figure7.PEGylationRetainedtheActivityofrhG-CSFinvitro.(Altho

6、ughTherelativeactivitiesofPEG(5kD)-G-CSFandPEG(20kD)-G-CSFwasdown-regulatedtoabout67%and40%,respectively,ofthatofunmodifiedrhG-CSF.)Mono-PEG-G-CSF热稳定性Figure8.PEGylationincreasedthethermalstabilityofrhG-CSF.Left:pH7.0in37℃;Right:pH7.0,at60℃Mono-PEG-G-CSFpH稳定性Figure9.PEGylatedrhG-CSFhaddistin

7、ctlyhigheracid-basestabilitythanunmodifiedrhG-CSF.Left:pH2.2;Right:pH11.0.Mono-PEG-G-CSF体外稳定性Figure10.PEGylationsignificantlyenhancedproteolyticstabilityofrhG-CSF.Left:humanserum;Right:trypsin.Mono-PEG-G-CSF的体内活性Figure11.Theactivityofmono-PEG-G-CSFtoincr