蛋白质的定量测定一-双缩脲法

蛋白质的定量测定一-双缩脲法

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1、浙江中医药大学生命科学学院生物化学教研室蛋白质含量测定引言:蛋白质的定量分析是生物化学和其他生命学科最常涉及的分析内容,是临床上诊断疾病及检查康复情况的重要指标,也是许多生物制品,药物、食品质量检测的重要指标。在生化实验中,对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析,则是经常进行的一项非常重要的工作。目前测定蛋白质含量的方法有很多种,下面列出根据蛋白质不同性质建立的一些蛋白质测定方法:物理性质:紫外分光光度法。化学性质:凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry法等。染色性质:考马斯亮蓝染色法、银染法。其他性质:免疫比浊法。蛋白质的定量测定——双缩脲法实验

2、目的要求1、学习分光光度法原理,了解分光光度计的结构。2、掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理及方法。3、了解标准曲线的制作方法及其在物质定量测定中的应用。分光光度法原理分光光度法,常被用来测定溶液中存在的光吸收物质的浓度,其基本原理是根据Lambert和Beer定律。Lambert定律一束平行单色光垂直照射于一均匀物质(溶液)时,由于溶液吸收一部分光能,使光的强度减弱,若溶液的浓度不变,则溶液的厚度愈大,光线强度的减弱也愈显著。设:入射光强度为I0L表示溶液的厚度(即光程)出射光(透过光)强度为I根据辐射能理论推导,I0与I之间关系为lg(I0

3、/I)=K1L(1)K1是常数,受光线波长、溶液性质、溶液浓度的影响。Beer定律当一束单色光通过一溶液时,光能被溶液介质吸收一部分,若溶液的厚度不变,则溶液浓度C愈大,光吸收愈大,透射光线强度的减弱也愈显著,光强度减弱的量与溶液浓度增加量成正比lg(I0/I)=K2C(2)K2为吸收系数,是常数,溶液对光吸收的大小与溶液浓度C成正比。Lambert-Beer定律(又称吸收定律)上二式合并(即(l)与(2)合并)lg(I0/I)=CL令A=lg(I0/I),T=I/I0;则A=CL,A=-lgT。T为透光率,A为吸光度(光密度、消光度)。

4、其中为常数,又称消光系数(extinctioncoefficient),表示物质对光线吸收的能力,其值因物质种类和光线波长而异。对于相同物质和相同波长的单色光则消光系数不变。分光光度计的结构光源:钨灯和氢灯(或氘灯)单色器:分解为单一波长光的装置狭缝:调节入射单色光的强度,形成平行光线吸收池:又称比色杯、比色皿、比色池,装待测溶液用检测系统:感受光能,转化为电能,输出A值、T值。本室几类分光光度计22PC型可见光分光光度计UNICO2000型S54型紫外分光光度计UV8500型紫外分光光度计比色杯(比色皿)玻璃比色杯石英比色杯荧光比色杯比色

5、杯使用注意事项1、拿取比色皿时,只能用手指接触两侧的毛玻璃,避免接触光学面。2、不得将光学面与硬物或脏物接触。盛装溶液时,高度为比色皿的2/3处即可,光学面如有残液可先用滤纸轻轻吸附,然后再用檫镜纸擦拭。3、比色皿在使用后,应立即用水冲洗干净。必要时可用1:1的盐酸浸泡,然后用水冲洗干净。4、不能将比色皿放在火焰或电炉上进行加热或干燥箱内烘烤;5、在测量时如对比色皿有怀疑,可自行检测。微量移液器吸嘴装在吸液杆上,应套牢避免间隙。依据所需容量旋转手轮,使数轮显示所需值。轻轻地将推动按钮下压,使推动按钮推移至第一停点位置。手持取液器垂直浸入溶液中

6、,吸嘴浸入深度为2-4mm,停留2-3秒后缓慢放松按钮,即回到原来位置,溶液吸入后稍停即可将吸嘴移出液面。将取液器吸嘴置于排液容器内。使吸嘴尖紧贴容器内壁,按压推动按钮至第二停点位置,使溶液排尽,松开按钮。移液完毕,按压卸嘴按钮,将吸嘴脱卸。【实验原理】具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应,因此蛋白质在碱性溶液中,也能与Cu2+形成紫红色络合物,颜色深浅与蛋白质浓度成正比,故可以用来测定蛋白质的浓度。紫红色铜双缩脲复合物分子结构为:但必须注意,此反应并非蛋白质所特有,凡分子内有两个或两个以上的肽键的化合物以及分子内有H2NOC-NH-

7、CONH2等结构化合物,双缩脲反应也呈阳性。【实验材料】1.试剂(1)双缩脲试剂:取1.50g硫酸铜(CuSO4·5H2O)和6.0g酒石酸钾钠(NaKC4H4O6·4H2O),用500mL水溶解,在搅拌下加入300mL10%氢氧化钠溶液,1.0gKI;用水稀释到1000mL,贮存于塑料瓶中(或内壁涂以石蜡的瓶中),避光保存。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色或暗红色沉淀出现,则需重新配制。2.标准和待测蛋白质溶液:(1)标准蛋白溶液:10mg/ml牛血清白蛋白溶液或相同浓度的酪蛋白溶液(用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制)。作为标准用的蛋

8、白质要预先用微量凯氏定氮法测定蛋白质含量,根据其纯度称量,配制成标准溶液。(2)待测蛋白质溶液:测定血清等样品时需做适当稀释,使其浓度在标准曲线测试范围内。3.器材

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