蛋白质工程与蛋白质组研究

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1、蛋白质工程与蛋白质组研究化学与生物工程学院主讲人：冉秀芝Tel：138832763581克隆基因的表达1.1中的外源基因在大肠杆菌表达载体1.2在大肠杆菌中表达重组蛋白存在的问题1.3真核细胞中重组蛋白的表达图1-1在大肠杆菌中基因表达的3个重要信号启动子核糖体结合位点基因终止子DNARNA转录核糖体结合mRNA位点图1-2基因转录起始位点上游序列的比较TTGACATATAATPu>Py-35区-30-70正调控区-20负调控区+1-10区GC区….CAAT区TATAAATPuAPy-40-110+1-20-30增强子CCGCCC或GGGCGG或GGCC

2、AATCTTA原核真核图1-3通过表达载体在大肠杆菌中被表达PRTTPRTPRmRNA蛋白质表达载体外源基因将外源基因插入限制性酶切位点转化大肠杆菌图1-4杂交基因的构建和融合蛋白的合成PRTPRT插入外源基因｝ATATTA正确融合N端C端不正确融合外源基因不被翻译表达ATATTAGGAGCTGGAGC融合蛋白亲和层析法纯化化学试剂除去大肠杆菌肽段图1-5在大肠杆菌中表达外源基因长遇到的问题翻译转录PRTT转录大肠杆菌不能切除内含子转录提前终止在真核细胞中表达重组蛋白用酵母和丝状真菌表达重组蛋白（酿酒酵母）动物细胞中表达重组蛋白（哺乳动物、昆虫）利用活的

3、动物和植物生产重组蛋白（生物体制药）图1-6真核细胞表达载体常用的4种启动子P半乳糖转录GAL10P甲醇转录乙醇氧化酶基因（a）GAL启动子（b）AOX启动子（c）葡萄糖水解酶启动子（d）纤维二糖水解酶启动子P纤维素转录纤维素二糖水解酶基因P淀粉转录葡萄糖淀粉酶基因木糖不转录图1-7将转基因体细胞的细胞核转入卵母细胞卵母细胞体细胞DNA溶液移去细胞核移出细胞核植入代孕母亲体内携带人血清白蛋白基因的转基因试管牛“滔滔”从植物中获得重组蛋白烟草叶片表达B型肝炎抗原2蛋白质工程2.1什么叫蛋白质工程指通过改造与蛋白质相应的基因中的碱基顺序，或

4、设计合成新的基因，将它克隆至受体细胞中，通过基因表达而获得具有新的特性的蛋白质（酶）技术。这是一门从改变基因入手，定做新的蛋白质的技术。故有人将其称为“第二代基因工程”1983年，美国生物学家额尔默首先提出了“蛋白质工程”的概念。根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质；确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系；从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生物功能，设计合成具有特定生物功能的全新蛋白质。2.2蛋白质工程研究的主要内容1、蛋白质工程的理论设计：包括活性设计、专一性设计、框架（构象）设计等。由于对蛋白质的结构与功能之间的关系认识还不系统

5、，目前的蛋白质设计仅仅是对天然蛋白质的修饰。如：异常血红蛋白的氨基酸取代去羧基端胰岛素等。2.3蛋白质工程的一般技术不同动物胰岛素在A链中的差异羧基端2、基因修饰——点突变法蛋白质结构的改变通过基因修饰来完成基因修饰的方法：⑴基因的全化学合成按照所需蛋白质的氨基酸顺序，先后合成结构基因、转录的起始信号及终止信号、限制酶切位点等核酸片段，然后用连接酶将各片段连接起来，通过基因工程转移到细菌中进行目标蛋白质的表达。目前用此法已合成了：人血细胞干扰素、胰岛素、生长激素释放抑制激素等基因。调节基因启动基因结构基因终止基因连接酶完整基因⑵基因直接修饰法将连接于质粒

6、上的某一蛋白质的基因用酶法去除一小段，然后用合成的核苷酸片段接上，从而获得新的突变体。已修饰过的酶有：内酰胺酶、酪氨酰tRNA合成酶、二氢叶酸还原酶等酶蛋白。限制性内切酶外源DNA限制性内切酶退火重组质粒转化受体细胞筛选表达带重组体的细胞目的产物质粒目的基因酶切割蛋白基因核苷酸片段新突变质粒⑶盒式突变1985年Wells提出的一种基因修饰技术，一次可以在一个位点上产生20种不同氨基酸的突变体，可以对蛋白质分子中重要氨基酸进行“饱和性”分析。酶切割蛋白基因核苷酸片段新突变质粒同时获得多个突变体2.4蛋白质工程的应用酶特性的改造包括酶催化活性、专一性、稳定性

7、等的改造。蛋白质或肽类药物的改造和新药的研制1、酶特性的改造⑴改变酶的催化活性酪氨酰tRNA合成酶Thr5151Pro改造活力25倍⑵改变酶的专一性枯草杆菌蛋白酶活性中心枯草杆菌蛋白酶活性中心SerCys（水解蛋白质）改造水解硝基苯酯专一性改变2、药物设计如抗病毒药β-干扰素稳定性的改进。-SH17形成二聚体失去活性-OH17氨基酸取代×二聚体二硫键由于蛋白质工程可以按照人的意愿定向改造蛋白质和酶，必然有着广泛的前景！第14章主讲人：冉秀芝化学与生物工程学院E-mail:ranxiuzhi2006@cqit.edu.cn3基因克隆和DNA分析在医学中的应

8、用重组药物的生产人类疾病相关基因的识别和鉴定基因治疗3.1重组药物的生产3.1.