酶与蛋白质工程-第1章-蛋白质与蛋白质工程.ppt

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1、第一讲蛋白质与蛋白质工程蛋白质在生命活动中的重要作用生物催化作用：酶运输作用：如血红蛋白、转铁蛋白调节作用：如胰岛素、生长激素运动作用：如肌动蛋白和肌球蛋白防御功能：如免疫球蛋白、凝血因子营养功能：如卵清蛋白、酪蛋白结构蛋白：如胶原蛋白、角蛋白能量转换蛋白：如细胞色素基因调节蛋白：如阻遏蛋白蛋白质在机体内的生物学功能蛋白质的基本结构单位—氨基酸氨基酸的基本结构和构型存在于自然界的氨基酸有300种。动物机体的蛋白质经强酸水解之后可以得到20种氨基酸，并且均为L-氨基酸（除了甘氨酸），含不对称的α-碳原子。它们之间的差别

2、在于有不同的侧链基团R氨基酸结构通式或H甘氨酸CH3丙氨酸L-氨基酸的通式R除了甘氨酸外，其他均具有不对称碳原子，具有旋光性含非极性侧链基团含极性侧链基团Ser,SThr,TCys,CPro,PAsn,NGln,QGly,GAla,AVal,VLeu,LMet,MIle,I含芳香基团含碱性侧链基团（带正电荷）Phe,F;Tyr,Y;Trp,WLys,K;Arg,R;His,H含酸性侧链基团（带负电荷）Asp,D;Glu,E氨基酸的两性解离氨基酸分子在水溶液中呈两性离子状态，在其等电点时，氨基酸所带的正、负电荷相等，净

3、电荷为零。pH=pI+OH-pH>pI+H++OH-+H+pH

4、peptidebond）和肽（peptide）肽键：指蛋白质分子中，由一个氨基酸的α-COOH和另一个氨基酸的α-NH2之间脱水缩合而成的酰胺键，它是蛋白质结构中的主要共价键肽：由肽键形成的化合物（二肽、三肽、寡肽、多肽）+-HOH肽键NH-CH-CHOHOOH甘氨酸多肽（polypeptide）和多肽链（polypeptidechain）在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸序列，多肽链上不完整的氨基酸，称为氨基酸残基(aminoacidresidue)上图为：丝氨酰-甘氨酰-酪氨酰-丙氨酰

5、-异亮氨酸（N-端）（C-端）—C—NH—OOCa—CN—CaH键长介于单双键之间O–—CNH—+肽键的结构特点氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用，肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转肽平面/酰胺平面肽平面—由肽键周围的6个原子组成的刚性平面由于α-碳原子与其他原子之间均形成单键，因此两相邻的肽键平面可以作相对旋转Ca肽平面一个具有生物活性的蛋白质多肽链在一定条件下往往只有一种或很少的几种构象。主要是因为肽链结构的高度共振稳定性蛋白质的一级结构一级结构（primarystructure）：即蛋白质的

6、化学结构，是指多肽链上各种氨基酸残基的种类和排列顺序，也包括二硫键的数目牛胰岛素的一级结构：51个氨基酸，A（21肽）、B（30肽）两条肽链，A链内一对S-S，A和B链间2对S-S蛋白质结构将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序将肽段分离并测出顺序专一性裂解末端氨基酸测定拆开二硫键纯蛋白质蛋白质顺序测定基本战略一级结构测定的基本流程:(1)拆分蛋白质分子的多肽链;(2)鉴定多肽链的N一末端和C一末端残基;(3)用两种或几种不同的断裂方法将多肽链裂解成较小的片段;(4)测定各肽段的氨基酸序列;(5)重建完整多肽链的一级结构

7、;(6)确定半胱氨酸残基间形成的二硫键的位置①拆分非共价键：可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理②拆分二硫键：几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基拆分N-末端和C-末端氨基酸残基的确定—为氨基酸序列排列建立两个重要的参考点N端分析方法：①二硝基氟苯法(DNFB法)②丹磺酰氯法(DNS法)丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质③苯异硫氰酸(酯)法(PITC法、PTC法、PTH法、Edman降解法)由于其连续反应特性，成为蛋白质序列分

8、析仪的分析原理！C末端分析方法肼解法：多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离多肽链部分裂解成较小的片段—化大为小，获得短肽段酶解法:胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶等胃蛋白酶：在疏水性氨基酸处部分水解，最适反应pH为2~3胰蛋白酶：