蛋白质工程原理与技术

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1、蛋白质工程与原理技术1、什么是蛋白质工程？P1答：蛋白质工程（Proteinengineering）是通过対蛋白质结构与功能关系的了解，借助于生物信息学的知识和手段,利用基因定点诱变和基因重组等技术特界性地改造蛋白质的结构基因，产生具有新的特性的蛋白质的技术。2、什么是基因定点诱变？答：就是在DNA水平上，通过对蛋白质结构基因中某个或某些氨基酸编码顺序加以改变，从而改变蛋白质结构的技术。该技术不仅可川于改造天然蛋自质，而且可以用丁•确定蛋口质屮每一个氨基酸在结构和功能上的作用，以收集有关氨基酸线形顺序与其空间构象和生物学活性Z间的对应关系，为人工改造蛋白质提供理论

2、依据。氛什么是表达载体？m答：表达载体：就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（转录和翻译所必需的■皿序列，如启动子、终止子等），使外源血片段能够在宿主细胞中表达蛋白质。包括原核细胞表达载体和哺乳动物细胞表达载体两类。4、什么是克隆载体？m答：克隆载体：在载体上插入合适大小的外源片段，并引入到猶主细胞中进行大量繁殖，使外源*a片段得到大量扩增。■、基因克隆的基本程序？m答：（I）获得目的基因；（2）与克隆载体连接，形成新的重组树分子；o）用重组规分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；（4）对转化子筛选和鉴定；（1）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，

3、获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。&、真核基因在大肠杆菌中的表达方式？（条件）W4答：基本条件：①大肠杆菌没有剪切内含子的功能，所以，真核细胞的冃的基因必须来自于②真核基因■Mik缺乏结合细菌核糖体的»序列，因此皿的起始密码子GTO上游部分9'端非编码区》是无川的，必须除去。对于一些分泌性蛋白，还应除去信号肽部分；③表达载体应是含有人肠杆菌Mik聚合酶所能识别的启动子和S•序列的人肠杆菌表达载体.④载体上只能用大肠杆菌启动了，将外源基因克隆在启动子下游，以便大肠杆菌Vik聚合酶识别启动子，并带动真核基因在人肠杆菌细胞屮转录。目前，商用表达载体都含有启动子和S

4、•序列，无需自己构建，只要选择合适的载体即可■⑤为提鬲表达效率，应根据启动子类型和特定的蛋白质，选择合适的菌株和诱导条件。表达方式：真核基因在匚亠中可以表达为：融合蛋白：融合蛋白的氨基端是原核序列，竣:基端是真核序列。表达融合蛋白的必要条件是条件：将真核基因连接在一段原核基因的下游后，真核基因的读码框架必须与原核基因的读码框架相符合。非融合蛋白：非融合蛋白是指在细菌内表达的蛋白以真核蛋白・山£的file为起始，在其氨基端不含任何原核多肽序列。为此，表达非融合蛋白的操纵子须改建成：原核启动子一原核s•序列一真核基因的起始密码子、结构基因及终止密码子。分泌型蛋白：将真

5、核基I大I重组于编码原核蛋白信号肽序列的下游，以表达带有原核蛋白信号肽的融合蛋白。这种融合蛋片当分泌到位于匚4细胞内膜与外模之间的周质时，其信号肽可被信号肽酶切割，而真核蛋口分泌至胞外。信号肽最终被水解。久什么■口是寡核昔酸定点诱变？pw答:按照休外重组技术，将待诱变的日的基因插入到噬菌体上，制备此种含有口的基因的单链即正链站血再使用化学合成的含有突变碱基的寡核廿酸短片段作引物，卅动单链分子进行复制，随后这段寡核昔酸引物便成为新合成的“孔了链的一个组成部分。为了使冃的革因的特定位点发生突变，所设计的寡核百酸引物的序列除了所需的突变碱慕外，其余的则与n的基因编码链的

6、特定区段完全互补。■、什么是相定点诱变？P4t答：①将待诱变靶基因克隆到质粒载体上，并分装到两个反应管中■②在每一个反应管中加人两种特定的引物，其中引物I和彳均含何错配核廿酸、但两个引物分别与质粒涨的不同链不完全互补，引物2和4均不含有错配核芹酸，二者分别与质粒的引物I和2杂交链的互补链完全互补I③进行PCu扩增获得含有突变碱基的线型质粒BiiXi④将两个反应管中的线型质粒混合，再经过变性和复性，一个反应竹中的一条链和另一个反映管中的互补链杂交，通过两个粘性末端形成带有切口的环状■冠分子■⑤转化入环状B/ik分子的切口可被Lwlt修复。9、什么是盒式诱变（■日饲■

7、•oris）P4t答:盒式诱变（JoH*MjD利用一段人工合成的具有突变序列的寡核井酸片段，即寡核昔酸盒，取代野生型基因中的相应序列。■、二硫键与蛋白质稳定性及活性的关系？P43答：⑴加入二硫键二硫键（-■+）的数量与蛋白质的稳定性有关，增加蛋白质分子中的二硫键，可提高蛋白质分子的热稳定性、有机溶剂稳定性和酸碱稳定性。在有活性的酶中，打算改变成半胱氨酸残基的氨基酸在空间上要相互靠近。这种空间上的邻近能确保整个分子构型将会基本上不受新的二硫键连接形成的影响。目标氨基酸和酶的活性位点没有关系。⑵减少游离3残基的数目在利用“厲重组技术表达外源基因中，常常会遇到外源蛋白的

8、表达虽很大