红细胞膜蛋白提取流程

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1、红细胞膜蛋白提取鉴定内容1.红细胞膜提取2.膜蛋白提取及定量测定（Lowry法）3.膜蛋白电泳分离、分子量测定SDS-PAGE4.westernblotting鉴定β-actin实验报告要求：分别按上各点，写出：原理，操作步骤，结果，讨论，结论手写，A4纸大小，报告首页写明实验者，专业。实验分组每个班分三大组，每组十人左右，选出组长实验进行一大组为单位1.纯化RBC膜2.SDS-PAGE2块胶（一个凝胶架）3.westernblot4.3-4人一小组测定蛋白质含量一.红细胞膜提取制备（低渗法）原理：RBC置低渗缓冲液(pH7.4)，破裂溶血－－溶血液。溶血液置高速离心作用中，去除溶液中Hb

2、和其它内含物，制得纯净的RBC膜－－称为血影“ghost”注意事项：1.离心步骤一定要“平衡、对称放置”2.溶血液离心后上清吸取小心，以免丢失“膜”3.缓冲液pH7.4，偏酸使Hb残留增加4.此分离方法适合于人、大鼠；牛、猪等易使脂蛋白脱落，1mMCaCl2可防止此种膜的不稳定性。5.本实验因条件限制，在常温离心。如需保持蛋白活性，应在4˚C离心。（1）RBC分离：15mlRBC液2000rpm5分钟RBC（沉淀）＋3倍体积等渗磷酸Buffer2000rpm5分钟×2洗净之RBC（2）溶血液制备RBC加入低渗磷酸buffer（>1:50)(在烧杯中）稍搅拌置冰箱冻格（4˚C）溶血过夜（以上

3、步骤已完成！！）溶血液，用“水泵”吸去上清。！！：膜很轻二、RBC膜纯化（洗涤）RBC膜转至1.5ml塑料管（2个/大组）9000rpm5’沉淀（膜）＋低渗磷酸Buffer（pH7.4)?ml（吹打）9000rpm5’×4沉淀＋等渗磷酸Buffer1ml9000rpm5分钟沉淀（RBC膜）＋0.6ml等渗Buffer（即为RBC原液）三、样品处理：1.SDS-PAGE用样品处理（一大组）：0.3mlRBC原液+0.3ml样品溶解液沸水浴5’2.Lowry法测定用样品处理(3-4人/group）：A.取0.3mlRBC原液＋1.5mlH2O＋150ulNaOH沸水浴5’待测管1：取A液0.1

4、ml＋0.9mlH2O待测管2：取A液0.3ml＋0.7mlH2O四、Lowry法测定膜蛋白含量立即摇匀，放置15分钟。以第６管为空白管，在分光光度计上以620ｎｍ比色，读取Ａ。以各管标准蛋白浓度为横座标，各管吸光度值为纵座标作图，画出标准曲线。2.红细胞膜样品蛋白含量的测定将待测管1、2同上加入碱性铜及酚试剂，一同测定管号试剂１２３４５６H2O(ml)0.90.80.60.40.21.0标准蛋白0.10.20.40.60.8__碱性铜试剂１１１１１１摇匀，放置１０分钟酚试剂３３３３３３含标准蛋白ug255010015020001.标准曲线制备作图：横坐标以标准蛋白含量纵坐标以A620吸光

5、度值图比例应为3:2（横：纵）计算：在标准曲线上查出待测样品的浓度，计算提取膜的Prmg数/ml样品注意稀释倍数要求：计算原提取RBC液的Pr含量五、SDS-PAGE测定膜蛋白分子量不连续电泳系统：电泳缓冲液pH离子强度与凝胶中不同（浓缩效应）（一）垂直板安装每套板两块玻璃下端对齐，夹好，放在胶架上！（二）凝胶制备（见表）先配好分离胶（留距齿梳1cm），待其凝固后，再配浓缩胶。（三）电泳装置安装先装内槽，试无渗漏；放入外槽中，加Buffer。上样品：每孔18ul，2块/组每块板留一标准蛋白孔（四）电泳：100V进分离胶调至80V约1.5小时10％分离胶10ml5％浓缩胶5ml30％凝胶储备

6、液3.31.0蒸馏水4.04.01.5mol/LTris-HClBuffer2.51mol/LTris-HClBuffer1.010％SDS0.10.0810％过硫酸铵0.06（60ul)0.06(60ul)TEMED8ul8ul加入过硫酸铵，TEMED即刻灌胶。（五）取胶:用专用板平面轻轻“橇”开板，推入小平皿中。注意：一块半干转移（浸入转移Buffer20min）另一块考马斯亮蓝染色染色2小时后，7%醋酸脱色（×4）每组做好标记（写好名字），交生化室扫描或摄像保留。分子量计算1.测量：cma.每条带距离（起始点至带中心）b.起始至示踪染料距离2.MR：条带距离(a)MR=起始至示踪染料

7、距离(b)ab1410062403024分子量KD迁移距离cmMR705540352515预染标准蛋白3.半对数图：（六条标准蛋白）（参照统计学散点法）横坐标为迁移率MR纵坐标为LogM（直接按每一蛋白分子量标在半对数图中）4.计算待测样品蛋白质分子量：选在标准蛋白迁移范围内的相应待测样品中的三条带，测量距离计算MR，Mw9876543210.10.20.30.4….横坐标为迁移率MR；（六条标准蛋白）纵坐标为LogM（