三结构域重组FN多肽表达质粒的构建及其表达产物性质的初步鉴定

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1、!"卷#期生物工程学报’()*!"+(*#$%%%年&月!"#$%&%’()*$+,(-.#(/%0"$(,(12,-).$%%%!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!三结构域重组!"多肽表达质粒的构建及其表达产物性质的初步鉴定李明才"冯作化""李东张桂梅（同济医科大学医学分子生物学研究室武汉#3%%3%）摘要为探讨三结构域重组纤连蛋白（4+）在肿瘤治疗中的作用，构建了两个三结构域重组4+表达质粒54/#0"$和54/#02$，它们分别编

2、码两个重组多肽：67"$（4+的89(!$3/0:;9!1!1经<;=和>)?!"/%0’?)$%#/相连）和672$（从67"$中删除了7;5@@6端和6;))@@结构域+端的89(!/130A)-!/&2）。含表达质粒54/#02$的工程菌经3&B培养，672$得到表达，表达产物主要以包涵体形式存在，经尿素变性与复性处理后，通过肝素0琼脂糖亲和层析纯化，纯化产物进行细胞粘附试验。67"$在大肠杆菌中的表达效率很低（1C），而672$的表达效率很高（$!C），提示4+分子中6;))@@结构域的+端顺序是影响三结构域重组多肽

3、在大肠杆菌中表达的关键结构。纯化的672$具有结合肝素和结合细胞的功能，且结合细胞的能力比双结构域4+更强。672$的制备为进一步研究具有更强的抑制肿瘤转移作用及免疫调节作用的基因工程制品奠定了基础。关键词纤连蛋白，重组多肽，肿瘤转移中图分类号D2!$文献标识码>文章编号!%%%03%"!0（$%%%）%#0%#�%#纤连蛋白（4EF9(G;H=EG，4+）含有$个能与细胞$$$#；54/#01%是6;))@07;5@@重组多肽的表达质结合的结构域（6;))@，6;))@@）和3个能与肝素结合粒［#］，在大肠杆菌中表达4

4、+的6;))@07;5@@双结的结构域（7;5@，7;5@@，7;5@@@）。4+的双功能结构域多肽（671%）。构域（6;))@07;5@@）重组多肽具有抑制肿瘤转移的#$%细胞功能［!］，能在肿瘤细胞侵入其它组织的几个关键步黑色素瘤细胞K!"／4!，购自美国>P66公司。骤中起抑制作用［$，3］，有效地阻止肿瘤细胞转移到#$&工具酶，’"(与蛋白质分子量标准肺和肝脏［3］。如果在6;))@I7;5@@双功能结构域P#J+>连接酶、限制酶、J+>与蛋白质分子量重组多肽的6端再加上4+的6;))@@结构域中的标准均购自华美生

5、物工程公司。［$］，但该多肽在大6:!片段，则重组多肽的功能更强#$)*+,引物肠杆菌中的表达效率却很低［!］。本文通过删除6:!根据人纤连蛋白7;5@@06;))@@结构域两端序列+端$"个氨基酸（89(!/130A)-!/&2），构建的J+>序列设计了两对引物（复旦大学遗传所合成）：6;))@07;5@@06:!三结构域重组多肽在大肠杆菌中43：1Q0666>AP66>PAA6P>PP66PA6>603Q；具有较高的表达效率，并对其表达产物作了功能鉴41：1Q0A>A>A>A>A>>A6PPAP6>PP6AA6AAAP0

6、3Q；定。4&：1Q066PP66>>P6>>A>P6P6A6P6PP603Q。#$-’"(片段的扩增与重组#材料与方法按文献［1］进行。86N扩增7;5@@06;))@@结构#$#菌种、质粒与重组多肽域的HJ+>片段经3+0@和5#$R@@@酶切后与相同大肠杆菌J71!，KL$!（JM3）和质粒54$%&，酶切的54/#01%质粒重组构建成质粒54/#0"$（表54/#01%均为本室保存，重组多肽671%为本室表达的多肽为67"$）；将86N扩增7;5@@结构域的达纯化。其中54$%&含有4+HJ+>的3+0@040(NH

7、J+>酶切分离得到的3+0@0.1,@@片段，54/#0"$@片段（3%&2F5），编码人纤连蛋白的:;9!!//08O;的.1,@@05#$R@@@片段，与3+0@和5#$R@@@酶切的收稿日期：!///0!%0$1，修回日期：$%%%0%#0$2。基金项目：国家自然科学基金资助项目（3/3&%&23）。"现工作单位：武汉市卫生防疫站，武汉#3%%$$。""通讯联系人。期李明才等：三结构域重组"1多肽表达质粒的构建及其表达产物性质的初步鉴定$$O&!"#$%&’质粒的大片段进行三片段连接构建成质粒片段与!"#$%:)中分离

8、的),)K!’.///%!"#9///!"#$%()（表达的多肽为*+()）。片段通过’.///位点连接，即可将23J,#&)和!"#工程菌的制备和诱导表达/3.,#O#直接连接在一起，从而删除了;FE,#&-%按文献［,］的方法进行诱导表达。23J,#O(这一序列，它包括+.!//结构域