流式细胞术应用技巧

《流式细胞术应用技巧》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、流式细胞仪应用技巧金从国2009.11深圳利用流式细胞仪(flowcytometer)通过检测荧光信号来检测细胞或其它颗粒性物质（表面或胞浆或胞核）的物理、化学特性并通过这些特性对细胞或颗粒进行定量。&检测表面标记物&检测胞浆标记物&检测胞核内标记物&检测可溶性蛋白流式细胞术（FLOWCYTOMETRY）一、流式细胞仪的原理——应用技巧的基础1、仪器的基本原理光源：激光(488nm氩离子空冷激光)细胞：单细胞悬液液流：鞘液(SheathFluid)流动室：FlowCell检测器：光电倍增管(PMT)检测信号：散射光(FS，SS)，荧光信号(FL1~FL4)统计分析：计算机散射

2、光信号FS细胞大小SS细胞颗粒性荧光信号FL1–FITCFL2–PEFL3–ECDFL4–PC5FL5-PC7用荧光标记抗体抗体特异性地结合细胞上对应的抗原表达该抗原的细胞被标记上荧光；抗原表达多的细胞荧光强度强阳性细胞百分比或浓度靶蛋白浓度2、标本处理原理（标记原理）（1）、直标和间标（2）、细胞膜标和细胞内标（3）、两种染色：抗体和染料（4）、组合标记间接免疫荧光标记法直接免疫荧光标记法抗原分布:Importantformethodoptimization表面，胞浆，核内是共同检测还是分别检测？表面胞浆核内CD3,CD4,CD8,tetramercytokinesDNAC

3、D3,4,8,tetramer+CytokinesCD3,4,8,tetramer+DNACytokines+DNACD3,4,8,tetramer+Cytokines+DNAIntracellularCytokine-Protocol2、提供的信息（1）、方案：两种图形（散点图、直方图）（2）、百分率信息、强度信息（3）、分群：细胞大小（FS）细胞内颗粒（SS）（4）、设阈值、设门特征（细分）（5）、直接信息、间接信息二、流式细胞仪的应用技巧一整合项目，树立体系化概念，提高流式使用价值白血病全过程评价患者出现症状各种抗原（参照白血病抗原选择原则）诊断白血病，确诊疾病，对白血

4、病进行分型以指导治疗治疗初诊时所用抗原中能够代表白血病细胞的特殊抗原评价疗效及治疗的疗程同上缓解期动态跟踪患者缓解期的白血病细胞变化，及时控制在相应水平下临床过程FCM检测项目意义CIK细胞治疗过程的评价治疗前病人免疫状况评价T亚群、NK、CIK、细胞因子是否适合做、能否能培养、值得做CIK采集MNCMNC数目、纯度、T亚群、NK、CIK数目及比例是否达到培养要求、调节细胞数MNC数目、T亚群、NK、CIK数目及比例、CD3、CD8活化状况培养培养是否达标、回输时机回输后T亚群、NK、CIK、细胞因子疗效评价、监测、下次治疗的时机CIK治疗程序FCM检测项目意义肿瘤细胞免疫特

5、点CD3CD4CD8CD4/CD8NKCIK正常正常正常正常正常正常正常正常正常正常正常AIDS全过程免疫细胞评价基础免疫水平T亚群、NK、CIK当地不同年龄、性别、民族的免疫水平基础数据高危人群—HIV检测阳性T亚群、NK、CIK、CD4凋亡、细胞因子HIV检测阳性前的免疫水平变化状况及CD4的凋亡T亚群、NK、CIK、CD3、CD4、CD8活化状况、细胞因子、CD4凋亡HIV阳性—AIDS检出HIV到发病的情况AIDS病人治疗T亚群、NK、CIK、细胞因子、CD4凋亡、CD3、CD4、CD8活化状况疗效评价、监测、治疗效果及病情动态观察AIDS过程FCM检测项目意义骨髓移

6、植或CD34细胞移植动员采集PBSC的冻存解冻和回输回输后免疫功能的监测并发症凋亡启动细胞内Ca2+动员★Caspase激活脱水致细胞皱缩核染色质凝缩★线粒体膜电位丧失★细胞膜PS外翻★核碎片形成★DNA被切割成低分子量片段细胞内酸化凋亡小体形成凋亡启动凋亡早期凋亡中期凋亡晚期三、流式细胞仪的应用技巧二利用仪器的灵活性，充分整合项目1、CIK细胞作用肿瘤细胞的凋亡分析2、不同细胞的转染、表达情况3、不同分型增殖的细胞分布4、sp细胞、非sp细胞5、肿瘤细胞诊断时（1）、胸腹水：把白细胞和癌细胞分开（2）、穿刺，手术细胞：6、组织中的浸润细胞：7、Th1/Th2细胞的分析四、流

7、式细胞仪的应用技巧三利用仪器提供的参数，对所做实验全面分析评价1、质粒转染中：转染率疫苗转染的强度2、同时分析转染率和转染强度3、稀有细胞的额外发现：T亚期中：CD45+、CD3+、CD4-、CD8-NK细胞：CD3-CD16+56+CD3+CD16+56+4、Tunecl方法中不同周期的凋亡状况细胞阻滞状况DNA断片发生时SOS状况五、流式细胞仪的应用技巧四了解相关知识及现有的评价方法，充分应用流式细胞1.白血病分型形态学、免疫组化、PCR2.细胞因子生物活性测定法、RIA和ELISA法、DNA分析法